基于Kisspeptin/GPR54系统探讨新加二甲地黄汤对PCOS模型大鼠卵泡发育的影响

目的探讨经新加二甲地黄汤干预后的多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)模型大鼠的卵泡发育情况及其可能存在的效应机制。方法筛选28只拥有规律动情周期的雌性SD大鼠,随机分为正常对照组、模型组、中药组及西药组,每组7只。除正常对照组外,其余三组均连续予来曲唑-羧甲基纤维素混悬液0.1mg/(kg·d)灌胃,以构建PCOS大鼠模型。自第22天起,中药组以新加二甲地黄汤5.268g/(kg·d)灌胃,西药组以炔雌醇环丙孕酮片0.286mg/(kg·d)灌胃,正常对照组及模型组均以10ml/(kg·d)蒸馏水灌胃。3周后比较各组大鼠卵巢系数,苏木精-伊红染色观察各组大鼠卵巢组织形态学改变,对各组大鼠血清激素均采用酶联免疫吸附试验进行检测,蛋白质印迹法检测卵巢亲吻素(kisspeptin,Kp)、G蛋白偶联受体54(G-protein-coupled receptor 54,GPR54)蛋白表达水平。结果与正常对照组比较,模型组大鼠卵巢内呈现为囊状扩张和闭锁的卵泡增多,其颗粒细胞层数变少,卵巢系数增大;血清睾酮(testosterone,T)、黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、Kp水平升高;血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)、雌二醇(estradiol,E2)水平及大鼠卵巢组织中Kp、GPR54蛋白表达均显著降低(P<0.05)。予中药干预后,与模型组比较,中药组大鼠卵巢囊样扩张卵泡数量变少,颗粒细胞的层数增多,存在近成熟的卵泡,并见少量黄体存在;大鼠血清LH、T、Kp水平下降,血清FSH、E2水平及卵巢Kp、GPR54蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论PCOS模型大鼠的卵泡发育情况经新加二甲地黄汤干预后得以改善,该治疗机制可能为通过调控Kisspeptin/GPR54系统影响FSH和LH的释放,以此影响激素含量,调整卵巢功能,使卵泡发育和排卵能力得以改善。

植物异三聚体G蛋白研究进展

植物细胞中的异三聚体G蛋白信号转导系统包括异三聚体G蛋白、G蛋白偶联受体、类受体激酶、G蛋白信号调节因子等,这些信号转导组分在感受物理及化学刺激、启动细胞内信号级联反应、调控细胞内代谢和基因表达过程中发挥重要作用.异三聚体G蛋白参与调控植物生长发育(如胚胎形成、营养器官生长、有性生殖等)、植物对生物及非生物胁迫的响应、根瘤形成等过程.因此,异三聚体G蛋白信号系统组分参与调控多种农作物的农艺性状,并最终影响农产品的产量和品质.对植物异三聚体G蛋白的结构、活化机制和生理功能等方面近年来取得的研究进展进行了回顾和总结.

黏附性G蛋白偶联受体F1在胰腺导管腺癌中的表达及其促进癌症进展的机制研究

目的·分析黏附性G蛋白偶联受体F1(adhesion G protein-coupled receptor F1,ADGRF1)在胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)发生及发展过程中的表达变化,探究ADGRF1对PDAC细胞增殖的影响以及促进PDAC进展的潜在分子机制。方法·基于癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库和基因表达综合(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库分析ADGRF1在正常胰腺组织及PDAC组织中的mRNA水平表达。利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)和蛋白质印迹法(Western blotting)检测ADGRF1在正常胰腺导管上皮细胞hTERT-HPNE及多种PDAC细胞中的表达情况。利用免疫组织化学染色(immunohistochemistry staining,IHC)检测PDAC患者的癌组织及癌旁组织中ADGRF1的表达差异。转染小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)敲低ADGRF1后,通过CCK8和平板克隆形成实验检测PDAC细胞AsPC-1、SW1990增殖能力的变化。构建稳定过表达ADGRF1的Patu8988细胞,通过CCK8实验检测过表达ADGRF1引起的PDAC细胞增殖变化。利用RNA测序(RNA-sequence,RNA-seq)、基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)和免疫浸润分析预测与ADGRF1促进PDAC癌症进展相关的信号通路。结果·TCGA数据库和GEO数据库的分析结果显示ADGRF1 mRNA在PDAC组织中的表达高于正常胰腺组织(均P=0.000)。qPCR和Western blotting结果显示,与hTERT-HPNE细胞相比,多种PDAC细胞中ADGRF1的mRNA和蛋白水平均有所上调(均P<0.05)。IHC结果显示ADGRF1在PDAC患者癌组织中的表达也高于癌旁组织。此外,下调ADGRF1能够抑制PDAC细胞AsPC-1、SW1990的增殖能力;而过表达ADGRF1则促进Patu8988细胞的增殖能力(均P<0.05)。RNAseq、GSEA富集分析和免疫浸润的结果显示,ADGRF1的表达与干扰素α(interferon-α,IFN-α)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)等信号通路有关。结论·ADGRF1在PDAC细胞和组织中高表达,促进PDAC细胞的增殖,其机制可能与多个免疫相关信号通路有关。

尼帕病毒G蛋白的结构与功能及其应用研究进展

尼帕病毒(Nipah virus,NiV)是一种高致死性的人兽共感染副黏病毒,能引发严重呼吸道疾病和尼帕病毒性脑炎,目前临床上无批准的用于人类感染的疫苗或治疗药物。NiV基因组共编码6种蛋白,其中G蛋白作为其受体蛋白以及重要的免疫原性蛋白,参与病毒入侵等过程,能刺激机体产生中和性抗体。因此,G蛋白在NiV致病性研究以及疫苗和检测技术研发方面具有巨大的潜在价值。本文对NiV G蛋白的结构和生理功能以及基于G蛋白的疫苗和检测技术研究现状进行综述,并展望了G蛋白的应用研究方向,以期为阐明NiV的致病机制和疫苗研发提供重要参考。

肝星状细胞特异性Grk2基因敲除小鼠模型的制备及鉴定

目的利用Cre-loxP基因敲除技术建立肝星状细胞特异性G蛋白偶联受体激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2,GRK2)基因敲除小鼠模型,为研究GRK2在肝星状细胞中的生物学功能提供动物模型基础。方法将loxP标记的Grk2基因小鼠(Grk2^(fl/fl))和Lrat-Cre工具鼠进行多次繁殖,建立肝星状细胞特异性Grk2基因敲除(Grk2^(ΔHSC))小鼠模型。观察和分析小鼠的生长繁殖情况;通过PCR反应鉴定flox和Cre基因型;免疫荧光双染检测肝星状细胞中GRK2表达;Western blot检测小鼠肝星状细胞及肺、脾、肾脏、心脏组织中GRK2蛋白表达;HE染色观察肝脏及肺、脾、心脏、肾脏组织学形态。结果成功鉴定Grk2^(ΔHSC)小鼠基因型;两组小鼠体质量、繁殖能力无明显差异;免疫荧光双染及Western blot结果表明,Grk2^(ΔHSC)小鼠的肝星状细胞中GRK2蛋白水平明显低于对照组小鼠,Grk2^(ΔHSC)小鼠肺、脾、肾脏和心脏组织中GRK2蛋白表达与对照组相比无明显变化;HE染色结果显示,Grk2^(ΔHSC)小鼠肝脏及主要组织结构与Grk2^(fl/fl)相比差异无显著性,可用于后续研究。结论本研究应用Cre-loxP技术成功构建了肝星状细胞特异性Grk2基因敲除小鼠,为进一步研究GRK2在肝脏中的作用提供了优良工具。

过量表达异三聚体G蛋白γ亚基基因RGG2提高水稻抗旱性

【目的】探究水稻异三聚体G蛋白γ亚基RGG2在提高水稻抗旱性中的作用。【方法】利用酵母双杂交和荧光素酶互补实验,鉴定RGG2与RGB1的相互作用。施加外源ABA,检测RGG2的表达水平和RGG2过量表达系的种子萌发率,用于阐明RGG2是否参与ABA响应。通过比较野生型和RGG2过量表达系的离体叶片失水率和干旱处理后的植株存活率,解析RGG2在干旱胁迫响应中的作用。【结果】RGG2与RGB1之间存在相互作用。RGG2的表达水平可以被ABA、PEG-6000和干旱处理显著诱导。ABA处理条件下,日本晴和武运粳7号背景下RGG2过量表达系种子萌发率和根长均明显下降,且显著低于野生型,表明RGG2正调控ABA响应。过量表达系离体叶片的失水率低于野生型,但干旱条件下的植株存活率高于野生型。干旱处理条件下,多个ABA和干旱胁迫响应相关基因的表达被诱导,并且在过量表达系中的表达水平明显高于野生型。【结论】RGG2正调控ABA和干旱胁迫响应,过量表达RGG2可以提高水稻抗旱性。

GPR120激动剂通过β-Arrestin2途径改善高糖诱导的海绵体内皮细胞功能障碍

目的探讨激活G蛋白偶联受体(GPR)120对高糖诱导的人类阴茎海绵体内皮损伤修复的影响,以期为寻找糖尿病性勃起功能障碍(DMED)新的药物开发靶点提供理论依据。方法收集海绵体植入手术患者术中废弃海绵体组织提取海绵体内皮细胞进行原代培养,用高浓度葡萄糖诱导内皮细胞损伤,再以GPR120激动剂治疗,观察对比不同处理的细胞一氧化氮(NO)释放量、细胞迁移、血管生成等功能。结果成功提取人类海绵体内皮细胞进行原代培养并鉴定;发现GPR120在人类海绵体内皮细胞中稳定表达,且与内皮型一氧化氮合酶(eNOS)存在共定位;与高糖损伤组相比,GPR120激动剂治疗组NO释放量、划痕愈合率和血管生成率均显著增加(P<0.05);沉默β-Arrestin2后GPR120激动剂失去原有的治疗效果。结论高糖培养可诱导海绵体内皮细胞功能障碍,GPR120激动剂能够治疗海绵体内皮功能障碍,沉默β-Arrestin2后GPR120激动剂无法改善内皮功能。

牛呼吸道合胞体病毒G和F蛋白的生物学功能

牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus, BRSV)是一种在世界范围内引起牛呼吸道疾病的病毒性病因之一,主要引起1岁龄以下犊牛的严重下呼吸道感染。BRSV共编码9种结构蛋白,其中附着蛋白(G蛋白)和融合蛋白(F蛋白)是BRSV表面主要的包膜糖蛋白,参与病毒吸附、融合宿主细胞的过程。G和F蛋白含多种识别表位,能够刺激机体产生中和抗体反应,常常是牛呼吸道合胞体病(bovine respiratory syncytial disease, BRSD)疫苗开发所关注的重点。探究G和F蛋白在BRSV侵染中的作用机理对于病毒致病机理分析、疫苗开发具有重要意义。本文旨在对牛呼吸道合胞体病毒G和F蛋白的结构功能及有关疫苗的开发加以综述,以期为BRSV疫苗的研制和BRSD的防控提供参考。

MiR-130c-5p靶向乌鳢水泡病毒g基因抑制病毒增殖

为了研究miR-130c-5p在乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus,SHVV)感染中潜在靶基因g的靶向关系以及对病毒复制的影响,本研究以斑点叉尾鮰卵巢(channel catfish ovary,CCO)为实验材料,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和免疫印迹(Western blot)技术测定SHVV不同感染时间和感染剂量条件下,病毒基因水平和蛋白水平以及miR-130c-5p变化情况。此外,将SHVV的g基因上miR-130c-5p对应的靶序列克隆到质粒pmirGLO,构建质粒pmirGLO-G用于双荧光素酶报告实验进行靶基因验证。结果显示,随着SHVV感染时间及剂量的不断增加,miR-130c-5p和g基因的表达水平都显著上调。进一步实验证明,miR-130c-5p类似物和pmirGLO-G质粒共转染可显著抑制荧光素酶活性强度,而转染miR-130c-5p抑制剂则明显上调了pmirGLO-G报告载体的荧光信号。此外,miR-130c-5p的过表达显著降低了病毒g基因的mRNA及蛋白表达,而抑制miR-130c-5p的表达则上调了g基因的mRNA及蛋白的表达水平。研究结果表明,miR-130c-5p通过靶向SHVV的g基因,引起G蛋白的降解,从而抑制SHVV的增殖。本研究结果为理解microRNA调控SHVV的致病机制提供了重要基础,为抗SHVV疫苗等药物的研发提供了理论支持。

G蛋白偶联受体39在小鼠脑出血后脑损伤的作用及机制研究

目的探究激活G蛋白偶联受体39(G-protein-coupled receptor 39,GPR39)对小鼠脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)后神经炎症和脑损伤的影响及其作用机制。方法176只雄性C57/BL6小鼠按随机数字表法分成8组:Sham组(n=42)、ICH组(n=34)、ICH+Vehicle组(n=32)、ICH+TC-G 1008组(n=44)、ICH+GPR39 siRNA组(n=6)、ICH+Scramble siRNA组(n=6)、ICH+TC-G 1008+666-15组(n=6)、ICH+TC-G 1008+Vehicle 2组(n=6)。通过小鼠自体血建立ICH模型。在小鼠ICH建模后1 h和25 h灌胃GPR39特异性激动剂TC-G 1008治疗。在ICH建模前24 h,通过侧脑室注射GPR39 siRNA、环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)抑制剂666-15分别抑制内源性的GPR39和p-CREB的表达。小鼠ICH后48 h,通过改良的加西亚实验、前肢置放实验、转角实验评估小鼠短期的神经功能缺陷,脑组织湿/干法测定脑含水量;免疫荧光检测血肿周围脑组织GPR39与神经元、小胶质细胞共定位和NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)在神经元中的表达情况;ELISA检测血肿周围组织中的白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β),肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的含量;TUNEL检测血肿周围凋亡神经元的数量;尼氏染色评估血肿周围神经元损伤情况;Western blot检测血肿周围脑组织中GPR39、p-CREB、CREB、NRLP3、裂解型半胱天冬酶1(Cleaved caspase-1,C-caspase-1)、gasdermin-D蛋白(GSDMD)的表达。结果GPR39在小鼠ICH后48 h达到表达高峰(P<0.05),在神经元和小胶质细胞均有表达。TC-G 1008(24 mg/kg)激活GPR39后显著改善了小鼠ICH后改良的加西亚实验评分,左前肢放置成功率和左转次数增加(P<0.05)。同侧基底节(basal ganglia,BG)和皮层(cortex,CX)的脑水肿显著减轻(P<0.05)。血肿周围凋亡和受损的神经元数量显著减少(P<0.05)。焦亡相关分子NLRP3、C-caspase-1、GSDMD的表达和炎症相关因子IL-1β、TNF-α、MPO的水平降低(P<0.05)。敲低GPR39和下调p-CREB的表达显著增加了小鼠ICH后血肿周围脑组织焦亡相关分子的表达和炎症相关因子的含量(P<0.05)。结论GPR39激活可能部分通过CREB信号通路抑制小鼠ICH后的神经炎症和脑损伤,GPR39可能是ICH后减轻神经炎症和脑损伤潜在的治疗靶点。

TGR5在心血管疾病中的作用研究进展

武田G蛋白偶联受体5(TGR5)是一种位于细胞膜表面的胆汁酸受体,广泛分布于体内许多组织细胞中,能被体内绝大多数胆汁酸直接激活。TGR5在多种生理和病理生理过程中发挥着重要作用,包括细胞Ca^(2+)转运、氧化应激、细胞增殖、炎症反应和线粒体代谢等,从而维持线粒体稳态和血管内膜功能,抑制动脉粥样硬化、心肌肥大、心肌梗死后心肌重塑等心血管疾病的进展。目前,随着许多胆汁酸及胆汁酸衍生物相关药物逐步投入临床应用,有必要进一步深入研究以明确TGR5在心血管系统中的作用。本文针对TGR5与心血管系统的相关性,从TGR5参与调节巨噬细胞、血管内膜功能、血管平滑肌、心肌细胞和线粒体代谢5个方面进行阐述,总结梳理最新的研究进展,以期为TGR5作为心血管疾病治疗靶点提供理论依据。

辣椒小G蛋白CaROP的生物信息学分析

【目的】研究辣椒内小G蛋白CaROP的生物学功能、蛋白理化性质、蛋白结构及系统发育关系。【方法】运用ProtParam、ProtScale、SignalP5.0、TMHMM、NetPhos3.1和NetCGlyc1.0等生物信息学软件分析9个CaROP蛋白的蛋白理化特性;运用SOPMA和SWISS-MODEL等生物信息学软件预测分析9个CaROP蛋白的结构;运用生物信息学软件MEGA11分析9个CaROP蛋白的系统发育关系。【结果】9个CaROP蛋白的亲水性总平均值均小于0,均为亲水蛋白,其中6个为稳定的亲水蛋白;9个CaROP蛋白均无信号肽,即均为非分泌性蛋白;9个CaROP蛋白无跨膜结构域,即均非膜蛋白;9个CaROP蛋白均存在磷酸化位点,均无糖基化位点。9个CaROP蛋白的主要二级结构原件为无规则卷曲和α-螺旋,其次是β-折叠,最后是β-转角。9个CaROP蛋白聚为4个分支,其中分支Ⅰ和分支Ⅲ各包括1个CaROP蛋白。分支Ⅱ包括2个CaROP蛋白,其余5个CaROP蛋白均聚于分支Ⅳ中。【结论】9个CaROP蛋白具有完整的Rho功能域,均为非分泌性亲水蛋白。9个CaROP蛋白在系统进化树中共聚为了4个分支,其三级结构建模的预测结果也均较为理想,9个CaROP蛋白结构较稳定。

血清sMICA、PCNA、GASP-1、TIMP-1在非小细胞肺癌患者中的表达及相关性分析

目的探讨血清可溶性MHC-I类链相关蛋白A(sMICA)、增殖细胞核抗原(PCNA)、G蛋白偶联受体相关分选蛋白1(GASP-1)、组织金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中的表达及与病理分型的相关性。方法2020年7月至2022年8月诊治的86例NSCLC患者作为研究对象,并设立为观察组,同期选取43例健康体检者设立为对照组;并根据不同病理分型将观察组分为腺癌组(n=33)和鳞癌组(n=53),对比血清sMICA、PCNA、GASP-1、TIMP-1;并采用Logistic回归模型分析sMICA、PCNA、GASP-1、TIMP-1对非小细胞肺癌的影响;采用ROC曲线模型分析sMICA、PCNA、GASP-1、TIMP-1诊断非小细胞肺癌的AUC、敏感度及特异度。结果观察组的sMICA、PCNA、GASP-1、TIMP-1均高于对照组(P<0.05)。腺癌组的sMICA、PCNA、GASP-1、TIMP-1均高于鳞癌组(P<0.05)。二元Logistic回归模型分析显示,sMICA、PCNA、GASP-1、TIMP-1高表达会对非小细胞肺癌的发生产生影响(P<0.05)。ROC曲线分析显示,sMICA、PCNA、GASP-1、TIMP-1及四项联合诊断NSCLC的AUC值分别为(0.750、0.654、0.819、0.788、0.843,P均<0.05),敏感度分别为57.00%、46.50%、67.40%、90.70%、79.10%;特异度分别为93.00%、93.00%、88.40%、58.10%、86.00%。结论sMICA、PCNA、GASP-1、TIMP-1在NSCLC患者中呈高表达趋势,其表达水平会随病理分型而升高。

G蛋白β2亚基对结直肠癌细胞转移能力的影响

目的探讨G蛋白β2亚基(GNB2)对结直肠癌细胞体外迁移和体内转移能力的影响及机制。方法将对数生长期人胚肾细胞293FT随机分为对照组和shGNB2组,对照组293FT细胞转染PSPAX2、PMD2G、Control质粒,shGNB2组293FT细胞转染PSPAX2、PMD2G、shGNB2质粒,分别收集病毒上清液。将对数生长期人结直肠癌细胞HCT116、RKO按随机数字表法分为对照组和shGNB2组,应用293FT细胞对照组病毒上清液转染对照组HCT116和RKO细胞,应用293FT细胞shGNB2组病毒上清液转染shGNB2组HCT116和RKO细胞,应用实时荧光定量聚合酶链反应法检测对照组和shGNB2组HCT116、RKO细胞中GNB2 mRNA的表达,Western blot法检测对照组和shGNB2组HCT116、RKO细胞中GNB2、波形蛋白(Vimentin)、神经钙黏蛋白(N-cadherin)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达,划痕愈合实验检测对照组和shGNB2组HCT116、RKO细胞划痕愈合率,Transwell小室实验检测对照组和shGNB2组HCT116、RKO细胞迁移细胞数。分别取对照组和shGNB2组HCT116细胞2×106个注射于裸鼠皮下,3周后取出皮下肿瘤,剪成1 mm 3大小的组织块。按随机数字表法将8只4~5周龄雌性裸鼠分为对照组和shGNB2组,每组4只;将对照组HCT116细胞皮下瘤组织块接种于对照组裸鼠回盲部肠浆膜处,shGNB2组HCT116细胞皮下瘤组织块接种于shGNB2组裸鼠回盲部肠浆膜处;记录裸鼠死亡时间,取出肝脏,观察肝脏肿瘤转移数。结果shGNB2组HCT116、RKO细胞中GNB2 mRNA和蛋白相对表达量显著低于对照组(P<0.01)。培养48 h时,shGNB2组HCT116、RKO细胞划痕愈合率显著低于对照组(P<0.01),shGNB2组HCT116、RKO细胞迁移数显著少于对照组(P<0.01)。shGNB2组裸鼠肝内转移瘤数显著少于对照组(P<0.05)。shGNB2组HCT116、RKO细胞中Vimentin、N-cadherin蛋白相对表达量显著低于对照组,E-cadherin蛋白相对表达量显著高于对照组(P<0.01)。结论干扰GNB2表达可有效抑制结直肠癌细胞的转移能力,其机制可能是GNB2通过调控上皮间质转化过程来参与结直肠癌细胞的转移。

琥珀酸/GPR91通过DHODH/CoQ10促血管内皮细胞线粒体损伤

[目的]探讨琥珀酸/G蛋白偶联受体91(GPR91)对血管内皮细胞线粒体的影响及其调节机制。[方法]采用透射电镜、Western blot、荧光显微镜观察琥珀酸类似物琥珀酸二乙酯(DS)、GPR91激动剂及抑制剂对血管内皮细胞线粒体形态、嵴、嵴稳态相关蛋白、活性氧(ROS)含量、Ca^(2+)浓度、膜电位、二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)表达以及氧化型辅酶Q10(CoQ10)的影响;荧光探针法观察DHODH抑制剂以及氧化型CoQ10对血管内皮细胞ROS含量、Ca^(2+)浓度的影响。[结果]DS处理后,血管内皮细胞线粒体固缩、体积变小、双层膜电子密度增加、嵴数量减少,嵴稳态相关蛋白MIC60表达下调23%,ROS含量升高,Ca^(2+)浓度增加,线粒体膜电位降低(P<0.05或P<0.01);GPR91激动剂处理后,线粒体嵴稳态相关蛋白MIC60表达下调31%,ROS含量升高27%,钙离子浓度升高36%,线粒体膜电位降低(P<0.05或P<0.01);GPR91抑制剂处理后,线粒体嵴稳态相关蛋白MIC60上调22%,ATP5I上调40%,ROS含量降低41%,Ca^(2+)浓度降低67%,线粒体膜电位恢复正常(P<0.05或P<0.01)。DS处理后,DHODH的表达下调43%,氧化型CoQ10的含量增加120%(P<0.05或P<0.01);GPR91激动剂处理后,DHODH的表达下调22%,氧化型CoQ10的含量增加36%(P<0.05或P<0.01);GPR91抑制剂处理后,DHODH的表达上调40%,氧化型CoQ10的含量降低39%(P<0.01);DHODH抑制剂处理后,ROS含量增加20%,Ca^(2+)浓度增加28%,线粒体膜电位降低(P<0.05或P<0.01);外源加入氧化型CoQ10处理后,ROS含量降低30%,Ca^(2+)浓度降低20%(P<0.05或P<0.01)。[结论]琥珀酸/GPR91可能通过影响线粒体嵴稳态下调DHODH的表达进而抑制氧化型CoQ10还原,导致线粒体损伤。

基于N和G蛋白的HeV抗体间接ELISA检测方法的建立

为了建立亨德拉病毒(HeV)抗体的间接ELISA检测方法,人工合成HeV的N和G基因,并将其分别连接到原核表达载体PET-30a,经IPTG诱导、变复性处理及纯化后获得表达蛋白,免疫健康马获得阳性血清,用矩阵法对蛋白包被浓度和一抗稀释倍数进行确定,优化包被时间、封闭剂以及孵育时间等技术参数,并对建立方法的灵敏性、特异性、重复性和准确性进行评估。经SDS-PAGE和Western blot验证,N和G两个蛋白均实现高效表达,间接ELISA方法中二者的最佳包被浓度分别为10μg/mL和8μg/mL,一抗血清的稀释倍数为1∶800,优化后的最佳反应条件为:N蛋白4℃包被过夜,5%脱脂奶粉37℃封闭2 h,一抗孵育时间30 min,二抗按1∶8000稀释后37℃作用60 min;G蛋白4℃包被过夜,2%BSA 37℃封闭2 h,一抗孵育时间80 min,二抗按1∶8000稀释后37℃作用80 min。结果表明,所建方法N蛋白的灵敏性大于1∶12800,G蛋白大于1∶6400,二者的临界值分别为0.235和0.267,特异性良好,批内、批间变异系数均小于10%,重复性良好,二者ROC曲线下面积分别为0.91和0.93,准确性高。试验结果可为海关、口岸以及出入境检验检疫等部门HeV临床血清学诊断提供技术支撑。

Long non-coding RNA CDKN2B-AS1 promotes hepatocellular carcinoma progression via E2F transcription factor 1/G protein subunit alpha Z axis

BACKGROUND A series of long non-coding RNAs(lncRNAs)have been reported to play a crucial role in cancer biology.Some previous studies report that lncRNA CDKN2B-AS1 is involved in some human malignancies.However,its role in hepatocellular carcinoma(HCC)has not been fully deciphered.AIM To decipher the role of CDKN2B-AS1 in the progression of HCC.METHODS CDKN2B-AS1 expression in HCC was detected by quantitative real-time polymerase chain reaction.The malignant phenotypes of Li-7 and SNU-182 cells were detected by the CCK-8 method,EdU method,and flow cytometry,respectively.RNA immunoprecipitation was executed to confirm the interaction between CDKN2B-AS1 and E2F transcription factor 1(E2F1).Luciferase reporter assay and chromatin immunoprecipitation were performed to verify the binding of E2F1 to the promoter of G protein subunit alpha Z(GNAZ).E2F1 and GNAZ were detected by western blot in HCC cells.RESULTS In HCC tissues,CDKN2B-AS1 was upregulated.Depletion of CDKN2B-AS1 inhibited the proliferation of HCC cells,and the depletion of CDKN2B-AS1 also induced cell cycle arrest and apoptosis.CDKN2B-AS1 could interact with E2F1.Depletion of CDKN2B-AS1 inhibited the binding of E2F1 to the GNAZ promoter region.Overexpression of E2F1 reversed the biological effects of depletion of CDKN2B-AS1 on the malignant behaviors of HCC cells.CONCLUSION CDKN2B-AS1 recruits E2F1 to facilitate GNAZ transcription to promote HCC progression.

Takeda G蛋白偶联受体5在血管平滑肌细胞增殖和迁移中的作用

目的探讨Takeda G蛋白偶联受体5(Takeda G protein-coupled receptor 5,TGR5)在小鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖和迁移中的作用及机制。方法用血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF-BB)诱导VSMCs增殖、迁移,以INT-777特异性激活TGR5,CCK-8试剂盒及增殖细胞核抗原(Ki-67)免疫荧光染色用于检测细胞增殖能力,划痕试验用于检测细胞迁移能力。Western blot检测TGR5蛋白水平变化。为探究TGR5在血管内膜增生中的作用,将40只雄性野生型C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、内膜损伤组、假手术+UDCA(熊去氧胆酸,TGR5激动剂)组及内膜损伤+UDCA组,每组10只。造模完成后按组分别予以口服普通维持饲料及含0.5%UDCA的普通维持饲料,持续21 d后分别取材,HE染色观察颈动脉内膜增生程度,Ki-67免疫荧光染色观察颈动脉内膜血管平滑肌增殖变化。结果特异性激活TGR5明显降低VSMCs增殖活力及Ki-67阳性细胞率,同时使VSMCs划痕愈合速度减慢。特异性激活TGR5使细胞内UCP2表达增加、活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平降低。过氧化氢恢复细胞内ROS水平后,TGR5抑制VSMCs增殖迁移的作用被削弱。激活TGR5能减轻颈动脉损伤后内膜增生。结论TGR5可能通过UCP2改善细胞内氧化应激,从而抑制小鼠VSMCs的增殖和迁移。

Rspo3/Lgr5促进N-钙黏蛋白表达参与小鼠肝损伤

目的本文旨在研究在损伤肝组织中,特异性顶部盘状底板反应蛋白3(R-spondin3,Rspo3)上调周细胞N-钙黏蛋白(N-cadherin,Ncad,基因名Cdh2)表达,从而参与小鼠肝损伤。方法采用反转录实时定量聚合酶链反应法(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)测定Rspo3,小鼠肝组织富含亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5(leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5,Lgr5)和Cdh2 mRNA表达情况;采用蛋白质免疫印迹方法以及免疫荧光染色方法测定Ncad定位以及表达情况;分离并培养小鼠原代骨髓间充质细胞(bone marrow mesenchymal stromal cell,BMSC),采用靶向Lgr5的RNA干扰实验以确定Rspo3是否通过作用于Lgr5上调Ncad表达。结果在损伤小鼠肝组织中,Rspo3及其受体Lgr5显著上调;肝损伤时黏附连接蛋白Ncad表达上调,且与Rspo3及Lgr5表达量呈正相关;Ncad主要定位于损伤肝脏的周细胞;使用Rspo3处理小鼠原代BMSC能够上调Ncad表达,Lgr5 siRNA能使Ncad水平下降。结论在小鼠损伤肝组织中,Rspo3通过作用于受体Lgr5,上调周细胞中Ncad表达,从而影响小鼠肝损伤。

MFG-E8和GNA14在子宫内膜异位症相关性卵巢癌中的表达及其临床意义

目的探讨乳脂球表皮生长因子8(MFG-E8)和G蛋白亚基α-14(GNA14)在子宫内膜异位症相关性卵巢癌(EAOC)中的表达及其临床意义。方法选取2015年5月—2017年5月华北医疗健康集团峰峰总医院EAOC患者51例(EAOC组)、非典型子宫内膜异位症(AEM)患者63例(AEM组)、卵巢型子宫内膜异位症(EMT)患者82例(EMT组)。收集所有患者的临床资料,并检测病变组织中MFG-E8、GNA14表达。对EAOC患者随访5年。采用Kaplan-Meier生存曲线分析EAOC患者的生存情况。采用多因素Cox回归分析评估EAOC患者死亡的危险因素。结果EAOC组MFG-E8阳性率为82.35%、GNA14阳性率为70.59%,均显著高于AEM组(41.27%、44.44%)和EMT组(25.61%、23.17%)(P<0.001)。MFG-E8高表达组和低表达组肿瘤直径、肿瘤级别、国际妇产科联合会(FIGO)分期、淋巴转移情况差异均有统计学意义(P<0.05)。GNA14高表达组和低表达组淋巴转移情况差异有统计学意义(P=0.009)。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示,MFG-E8高表达组和GNA14高表达组无进展生存期分别短于MFG-E8低表达组和GNA14低表达组(P<0.05)。多因素Cox回归分析结果显示,FIGO分期Ⅱ期、淋巴转移、MFG-E8高表达、GNA14高表达是EAOC患者死亡的独立危险因素[风险比(HR)值分别为2.337、2.519、3.133、3.080,95%可信区间(CI)分别为1.258~4.342、1.332~4.764、1.381~7.108、1.318~7.197,P<0.01]。结论MFG-E8、GNA14在EAOC患者癌组织中呈高表达,且与患者预后不良密切相关,或可作为EAOC患者的预后评估指标。