高G-C含量突变型Foxo1转基因动物基因型鉴定PCR方法的建立

为解决因目的基因G-C(鸟嘌呤-胞嘧啶碱基对)含量过高导致的目的基因扩增困难,以及操作过程中多环节引起的DNA污染导致的假阳性问题.本研究以突变型Foxo1(Forkhead转录因子1)转基因小鼠作为对象,就高G-C含量转基因的PCR方法和多个环节避免DNA污染进行了探索,结果显示,实验中消除了PCR的假阴性和假阳性现象,得到了准确的突变型Foxo1转基因小鼠的基因型鉴定结果.

金银花nrDNA ITS区聚合酶链反应条件的研究

目的 :金银花nrDNAITS区序列G +C含量为 6 8% ,用常规的PCR方法扩增效果差。本研究通过改变扩增程序及使用改性剂的方法显著提高了金银花nrDNAITS区的扩增效率。方法 :分别从金银花叶及药材中提取总DNA ,通过优化扩增条件 ,对nrDNAITS区进行扩增 ,并比较了两种优化方法的差别及适应性。方法 1:提高变性温度至 97℃ ;方法 2 :添加混合改性剂 (DMSO 4 % 甘油 10 % )。结果 :与方法 1相比 ,方法 2可降低变性温度 5℃ ,升高退火温度 9℃ ,降低镁离子浓度至 0 .5mmol/L ,降低TaqDNA聚合酶用量至 0 .1U(30 μl体系 ) ,PCR产物量显著提高 ,且可消除植物DNA粗提物中杂质的干扰。结论 :通过提高退火温度及添加改性剂可克服高G +C含量金银花nrDNAITS区序列扩增的困难 ,该方法的建立有助于解决植物来源DNA模板的PCR扩增问题。

应用甜菜碱增加富含三核苷酸重复的高G--C含量DNA片段测序辨识度的最佳浓度探讨

目的通过在Sanger法测序体系中加入浓度梯度的甜菜碱，建立高辨识度的富含三核苷酸重复的高G-C含量DNA片段的测序体系。方法以G-C含量为72％无三核苷酸重复的Nogo-B基因cDNA的5’端序列（the 5’ terminal of Nago—BcDNA，Am-Nogo-B）及G-C含量为74％的富含CAG重复与CCG重复的Huntingtin基因cDNA的5’端序列（the 5’ terminal of huntingtin cDNA，Am-HTT）为例，在Sanger法测序体系中加入浓度梯度的甜菜碱，比较测序结果。结果Am—Nogo—B与Am-HTT基因测序体系中最适宜的甜菜碱浓度相差较大。甜菜碱浓度在0．8～1．2mol／L之间时，Am-Nogo-B测序结果质量最佳。甜菜碱浓度在1．6～2．4mol／L之间时，Am-HTT基因的测序质量最好。结果具有良好的可重复性。结论不同碱基组成类型的高G-C含量DNA片段，即使G-C含量接近，最适宜测序体系中甜菜碱浓度不同。探索出了适宜于增加富含三核苷酸串联重复的高Gc含量DNA片段测序辨识度的体系，可作为类似DNA片段测序的参考方法。