利用原核表达系统制备肾癌相关抗原G250/MN/CA Ⅸ

目的利用原核表达系统制备肾癌相关抗原G250/MN/CA Ⅸ。方法采用PCR法从原有质粒中扩增G250/MN/CAⅨ全长编码序列,将获得的编码序列片段插入pET32a(+)表达载体,转化Rosseta大肠杆菌,IPTG诱导蛋白表达,而后进行纯化及Westernblot鉴定。结果正确构建pET32a(+)/G250重组质粒,重组质粒转化Rosseta菌后,经IPTG诱导,在58000相对分子质量处有明确的条带。目的蛋白表达占菌体总蛋白的32.7%。89.9%的重组蛋白是可溶性的。Westernblot结果显示纯化后的蛋白可以与G250单克隆抗体M75特异性结合。结论在原核系统中成功进行G250/MN/CA Ⅸ的高效表达,为下一步的单克隆抗体制备和蛋白功能研究奠定了基础。

肾癌特异性抗原G250/MN/CAⅨ的克隆及真核表达

目的:克隆人肾细胞癌特异性抗原G250基因,使其能够在真核细胞中表达并锚定修饰于细胞膜上。方法:提取人肾透明细胞癌细胞的总RNA,用RT-PCR扩增出G250基因,插入含有人Igκ链前导信号肽、IgG-Fc和GPI锚定信号肽基因序列的真核表达载体pCI-neo-GPI中;将构建的重组质粒pCI-neo-GPI-G250转染RenCa细胞,利用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光检测G250在细胞中的表达。结果:构建的重组质粒pCI-neo-GPI-G250经测序正确;用各种方法对筛选得到的稳定转染细胞进行检测,均可以发现G250的表达,表达部位为细胞膜。结论:克隆出人肾细胞癌特异性抗原G250基因,且G250在RenCa细胞膜上可以正常表达,为进一步研究肾癌肿瘤疫苗的免疫原性提供了必要的前期准备。

G250、Ki-67和Bax在肾细胞癌组织中的表达与术后生存率的关系

目的检测G250/MN/CA(简称G250)、Ki-67和Bax在肾细胞癌及癌旁组织中的表达,探讨G250在肿瘤发展过程中的作用,以及G250、Ki-67和Bax表达对肾细胞癌患者术后生存率的影响。方法采用免疫组化SP法检测54例肾癌组织和18例癌旁组织中G250、Ki-67和Bax的表达。结果G250、Ki-67和Bax免疫染色位于肾癌细胞的细胞膜、细胞核和细胞质,三者在肾细胞癌与癌旁组织中的阳性表达差异均有统计学意义;Ki-67和Bax在肾细胞癌不同病理分级和临床分期中的阳性表达差异有统计学意义,而G250的阳性表达差异无统计学意义。随访的47例患者中,G250阳性组患者术后远期无瘤生存率低于G250阴性组,但二者间的差异无统计学意义;进一步研究表明G250阳性高表达的患者术后无瘤生存率明显高于低表达者,经Log-rank检验差异有统计学意义。Ki-67阳性组患者术后远期无瘤生存率低于Ki-67阴性组,二者间的差异无统计学意义。Bax阳性组患者术后远期无瘤生存率高于Bax阴性组,二者间的差异有统计学意义。结论G250作为一种新的肾细胞癌特异性标志物,在肾细胞癌尤其是肾透明细胞癌的诊断、筛选方面具有良好的前景,并可能影响患者的术后无瘤生存率,但其表达与肾细胞癌临床分期及病理分级无明显相关;肾细胞癌中Ki-67和Bax的表达与肾细胞癌临床分期及病理分级有明显相关性,后者的表达同时也会影响患者术后的无瘤生存率。联合检测肾细胞癌组织中G250、Ki-67和Bax的表达有利于早期诊断肾细胞癌,并有利于判断患者的预后情况,对临床工作有指导意义。

抗肾细胞癌异种化G250抗原基因疫苗的构建及真核表达

目的:构建含有人肾细胞癌特异性抗原G250主要T细胞表位区域、猴和鼠G250部分片段区域融合基因tG250的真核表达质粒,并在猴肾COS7细胞中表达。方法:通过基因合成和PCR技术构建人、猴和鼠G250区域融合基因tG250,将其插入含有人Igκ链前导信号肽(sig)、人IgG-Fc和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定信号肽融合基因序列的细胞膜锚定修饰真核表达载体pCI-Fc-GPI中;将重组质粒pCI-Fc-tG250-GPI转染COS7细胞,流式细胞仪和免疫荧光检测其表达情况。结果:tG250融合基因经测序正确,PCR和酶切鉴定证明已成功连入真核表达载体pCI-Fc-tG250-GPI中;流式细胞仪和免疫荧光检测显示,重组质粒pCI-Fc-tG250-GPI在COS7细胞中得到很好的表达。结论:成功构建了重组质粒pCI-Fc-tG250-GPI,且在COS7细胞中可以有效表达,为以G250抗原为靶点基因疫苗的后续功能研究打下良好基础。

肾癌肿瘤相关抗原G250/MN/CAⅨ基因的克隆、表达及鉴定

目的报道G250/MN/CAⅨ基因的克隆,蛋白表达及鉴定。方法从肾癌组织中提取总RNA,采用RTPCR法扩增G250/MN/CAⅨ全长cDNA,将获得的cDNA片段插入pET22b(+)表达载体,转化BL21大肠杆菌中,以IPTG诱导进行蛋白表达,SDSPAGE凝胶电泳观察结果,实验验证。结果克隆的G250/MN/CAⅨ基因经测序证实序列正确,构建重组质粒pET22b(+)/G250并在原核系统中表达G250/MN/CAⅨ重组蛋白,该蛋白具有较好的抗原性和特异性。结论成功完成G250基因克隆,为在G250蛋白纯化基础上进行抗体制备和G250功能研究提供了实验依据。