利用原核表达系统制备肾癌相关抗原G250/MN/CA Ⅸ

目的利用原核表达系统制备肾癌相关抗原G250/MN/CA Ⅸ。方法采用PCR法从原有质粒中扩增G250/MN/CAⅨ全长编码序列,将获得的编码序列片段插入pET32a(+)表达载体,转化Rosseta大肠杆菌,IPTG诱导蛋白表达,而后进行纯化及Westernblot鉴定。结果正确构建pET32a(+)/G250重组质粒,重组质粒转化Rosseta菌后,经IPTG诱导,在58000相对分子质量处有明确的条带。目的蛋白表达占菌体总蛋白的32.7%。89.9%的重组蛋白是可溶性的。Westernblot结果显示纯化后的蛋白可以与G250单克隆抗体M75特异性结合。结论在原核系统中成功进行G250/MN/CA Ⅸ的高效表达,为下一步的单克隆抗体制备和蛋白功能研究奠定了基础。

肾癌G250 MN／CAIX重组质粒DNA免疫效应的初步研究

[目的]观察PCDNA3.0-G250重组质粒在小鼠中诱导产生DNA免疫应答的特点及抑瘤效应。[方法] PCDNA3.0-G250质粒每隔2周肌注射Balb/c小鼠共3次,对照组同法肌注PCDNA3.0质粒。每次免疫10 d后眶后取血,间接免疫荧光法检测血清抗体。6周后取脾细胞观察体外细胞毒效应。同法免疫Balb/c小鼠,第3次免疫时皮下种植sp2/0- PCDNA3.0-G250细胞,观察肿瘤大小及小鼠生存期。[结果]DNA免疫后可检测到特异性抗体,抗体滴度随免疫次数增加逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.01)。体外CTL杀伤率与对照组差别有统计学意义。体内实验发现治疗组与对照组抑瘤效应无明显差异(P>0.05)。[结论]G250重组质粒DNA免疫能在小鼠巾诱导产生特异性细胞免疫及体液免疫,无明显体内抑瘤效应。

肾癌特异性抗原G250/MN/CAⅨ的克隆及真核表达

目的:克隆人肾细胞癌特异性抗原G250基因,使其能够在真核细胞中表达并锚定修饰于细胞膜上。方法:提取人肾透明细胞癌细胞的总RNA,用RT-PCR扩增出G250基因,插入含有人Igκ链前导信号肽、IgG-Fc和GPI锚定信号肽基因序列的真核表达载体pCI-neo-GPI中;将构建的重组质粒pCI-neo-GPI-G250转染RenCa细胞,利用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光检测G250在细胞中的表达。结果:构建的重组质粒pCI-neo-GPI-G250经测序正确;用各种方法对筛选得到的稳定转染细胞进行检测,均可以发现G250的表达,表达部位为细胞膜。结论:克隆出人肾细胞癌特异性抗原G250基因,且G250在RenCa细胞膜上可以正常表达,为进一步研究肾癌肿瘤疫苗的免疫原性提供了必要的前期准备。

CAIX/MN/G250 mRNA在肾癌根治术前后表达的检测

目的探讨肾癌相关蛋白CAIX/MN/G250 mRNA在肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)手术前后的表达水平及临床意义。方法应用RT-PCR技术检测57例RCC患者癌组织及术前外周血中CAIX/MN/G250 mRNA的表达情况,并选择15例癌旁肾组织、15例正常肾组织及40例健康人外周血作对照,对术前外周血CAIX/MN/G250 mRNA阳性RCC患者术后随访4周,并对其外周血CAIX/MN/G250 mRNA水平进行半定量检测。结果57例RCC患者,其CAIX/MN/G250 mRNA阳性率在外周血中为59.6%(34/57),癌组织中为78.9%(45/57),显著高于对照组(P<0.01)。在肾透明细胞癌患者的外周血及癌组织中,CAIX/MN/G250 mRNA的阳性率分别为76.2%(32/42)和95.2%(40/42),均显著高于相应对照组(P<0.01)。RCC患者外周血及癌组织中CAIX/MN/G250 mRNA阳性率均随临床分期的增加而增加(P<0.01)。34例外周血阳性患者CAIX/MN/G250 mRNA水平术前2h、术后7、14、21和28d分别为0.54±0.13、0.56±0.15、0.34±0.13、0.29±0.18和0.22±0.11。RCC患者外周血CAIX/MN/G250 mRNA水平在肾癌根治术后随时间的推移呈下降趋势(P均<0.05)。结论使用RT-PCR技术检测CAIX/MN/G250 mRNA对肾癌尤其是透明细胞癌有较好的特异性和敏感性。外周血CAIX/MN/G250 mRNA检测可作为肾癌微转移的检测指标用于RCC的诊断、疗效评价及预后判断。

肾癌G250/MN/CAIX抗原基因在酿酒酵母中的诱导表达及意义

【目的】观察G250抗原基因编码区cDNA全长基因片段在酿酒酵母中诱导表达情况,并初步探讨其作为肿瘤治疗中的意义。【方法】应用基因重组技术将人G250cDNA序列克隆入酿酒酵母穿梭诱导表达载体pYES2/NTC,构建重组酵母真核表达质粒pYES2/NTC-G250并转化酿酒酵母菌株INVSc1,筛选阳性克隆转化子,经半乳糖诱导表达后进行菌体全蛋白的Westernblot检测。【结果】成功构建pYES2/NTC-G250重组酿酒酵母诱导表达质粒,证实其能够在酿酒酵母中诱导表达,表达量随诱导时间而变化,8～12h达高峰。【结论】人G250基因片段能够在酿酒酵母中表达,为进一步探讨基因重组酿酒酵母G250疫苗抗肿瘤效应及其安全性打下基础。

千金子对表达人G250基因小鼠renca细胞增殖的影响

目的观察中药千金子对表达人G250基因小鼠renca细胞增殖的影响。方法利用DNA重组技术将成功扩增的人G250基因编码区序列定向插入到pRNAT-U6.1/Neo质粒真核表达载体中,得到重组质粒pRNAT-U6.1/Neo-G250,将该质粒转染renca小鼠细胞,经G418筛选获得抗性单克隆,扩大培养后经Western印迹鉴定人G250基因的表达。将该细胞在不同浓度含千金子二萜醇(111μg/ml、333μg/ml、1 000μg/ml、3 000μg/ml、9 000μg/ml)的培养基中培养,MTT法观察千金子二萜醇对表达人G250基因小鼠renca细胞体外增殖情况的影响。结果与空白对照组相比,24 h后实验组细胞增殖速度减慢,并随浓度增加增殖速度减慢越明显,空白组与3 000μg/ml及9 000μg/ml浓度组比较差异有明显统计学(P=0.006,P=0.000)。结论中药千金子使表达人G250基因小鼠renca细胞增殖能力降低,renca细胞体外生长被显著抑制。

G250抗原肽与HBcAg融合基因原核表达载体的构建及表达蛋白的免疫分析

目的构建肾癌G250抗原肽与HBcAg重组基因的原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C,并通过大肠杆菌进行原核表达并纯化,分析表达融合蛋白的免疫原性及抗原性。方法 PCR扩增编码G250抗原中249～268氨基酸的基因片段,将G250肽插入去除主要免疫优势区的重组质粒pGEMEX/HBcAg中,获得重组质粒pGEMEX/C-G250肽-C,为更换酶切位点,以pGEMEX/C-G250肽-C为模板,PCR扩增C-G250肽-C基因片段,最终将目的基因亚克隆入原核表达质粒pET28a(+)中,IPTG诱导融合蛋白表达,利用Ni 2+-NTA亲和层析法纯化重组融合蛋白,SDSPAGE鉴定融合蛋白的表达,纯化后融合蛋白经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中抗体的滴度。结果酶切及基因测序鉴定证实融合基因正确重组于表达质粒pET28a(+)中,原核表达并纯化后,该分离纯化融合蛋白纯度达95%以上,其相对分子质量约为22.35。BALB/c小鼠经4次免疫后,所有小鼠血清中均可检测到抗体,免疫第6周其血清中抗体滴度可达到1∶5.12×105,抗G250肽抗体滴度达到1∶6.4×104,抗HBcAg抗体滴度不超过1∶4×103。结论成功构建肾癌G250抗原肽与HBcAg重组基因原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C,在大肠杆菌中可高效表达,纯化后融合蛋白具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生高滴度和高特异性的抗体。

不同浓度千金子对G250基因高表达肾癌Renca细胞株Livin蛋白表达的影响研究

目的观察不同浓度千金子对G250基因高表达肾癌Renca细胞株Livin蛋白表达的影响.方法将125只大鼠分为正常对照组、模型对照组、高剂量千金子治疗组、中剂量千金子治疗组以及低剂量千金子治疗组,每组大鼠25只.正常对照组正常饲养,其余各组采用皮下注射法构建肾脏移植瘤模型.高剂量千金子治疗组、中剂量千金子治疗组以及低剂量千金子治疗组分别于成瘤5d后连续给予千金子治疗,注射浓度分别为20mg/mL、10mg/mL以及2.5mg/mL,剂量为200mg/kg,1次/d,连续15d接受千金子治疗.正常对照组与模型对照组造模后给予注射等剂量生理盐水.比较各组大鼠抑瘤率、G250基因蛋白、Livin基因蛋白的表达.结果与模型对照组相比,高、中、低剂量千金子治疗组5-25d平均抑瘤率较高（P〈0.05）,且各组平均抑瘤率呈逐渐增高趋势;与中剂量千金子治疗组以及低剂量千金子治疗组相比,高剂量千金子治疗组平均抑瘤率较高（P〈0.05）.与正常对照组相比,模型对照组,高、中、低剂量千金子治疗组肾脏组织中Livin基因表达水平较低（P〈0.05）;G250基因表达水平较高（P〈0.05）;与中剂量千金子治疗组以及低剂量千金子治疗组相比,高剂量千金子治疗组Livin基因表达水平较高（P〈0.05）;G250基因表达水平较低（P〈0.05）.结论高浓度千金子对肾癌Renca细胞株具有良好的抑制作用,可能与下调G250基因表达,上调Livin蛋白表达相关.

稳定表达人G250基因小鼠renca细胞株的建立

目的建立能够稳定表达人G250基因的renca细胞株。方法采用PCR扩增出人G250基因编码区长度的互补序列,根据DNA重组技术定向插入到pIRES-neo真核表达载体中,得到重组表达质粒pIRES-neo-G250。用阳离子脂质体介导法将该质粒稳定转染到renca小鼠细胞中,通过调整G418的浓度筛选出阳性的克隆,蛋白免疫印迹和免疫荧光测试验证人G250基因转染小鼠renca细胞株后的表达情况。结果经过限制性内切酶鉴定和序列分析发现pIRES-neo-G250重组质粒构建正确,蛋白免疫印迹结果表明,可以从稳定转染pIRES-neo-G250的小鼠renca细胞中检测到G250的蛋白条带,流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测结果表明,稳定转染pIRES-neo-G250的renca细胞用人的G250特异性抗体检测到有高效的荧光表达。结论成功建立了稳定、高效表达pIRES-neo-G250分子的人G250基因renca细胞株,为后续的肾癌疫苗研究奠定了基础。

考马斯亮蓝G-250染色法测定草乌中可溶性蛋白质含量

采用考马斯亮蓝G-250染色法对草乌药材中可溶性蛋白质含量进行了测定,建立了快速、灵敏的测定蛋白质的方法.结果表明,考马斯亮蓝G-250染色法简单、迅速,且相对较为准确,是测定低浓度蛋白质含量的有效方法.

荧光光谱法和分子模拟技术研究考马斯亮蓝G-250与牛血清白蛋白的相互作用

采用多种光谱技术结合圆二色谱技术研究了考马斯亮蓝G-250(CBBG-250)相互作用于牛血清白蛋白(BSA),探究了两者之间的作用机理。荧光光谱结果表明BSA与CBBG-250结合形式是静态猝灭,随CBBG-250浓度增加,其形成常数随温度逐渐减小,结合比为1∶1,根据Stern-Volmer曲线计算焓变值(ΔH)和熵变值(ΔS)分别为-4.38kJ·mol^(-1)和-6.16J·mol^(-1)·K^(-1),均小于零,证明该过程是一个自发过程。傅里叶红外光谱测定结果表明CBBG-250的加入引起BSA结构的变化,随着CBBG-250溶液浓度的增加,BSA中色氨酸微环境极性被改变,在1 600~1 700cm^(-1)(酰胺带Ⅰ)和1 600~1 500cm^(-1)(酰胺带Ⅱ)处的特征吸收带蓝移。其中1 650cm^(-1)移动至1 710cm^(-1),1 544cm^(-1)移动到1 573cm^(-1),显示BSAα-螺旋(1 650~1 658cm^(-1))和β-折叠(1 620~1 640cm^(-1),1 675cm^(-1))结构发生变化,且α-螺旋含量比结合前有所降低。圆二色谱分析结果表明,两者间通过氢键和范德华力为主的作用力使得BSA二级结构发生变化,α-螺旋含量由42.15%下降至1.27%,该结果进一步被分子建模对接技术证明。

一种简便的考马斯亮蓝G250蛋白质染色方法

介绍一种快速、简便、几乎无背景的考马斯亮蓝G2 5 0 (CBBG2 5 0 )染色方法 .该方法所用试剂仅为稀盐酸和CBBG2 5 0 ,CBBG2 5 0的工作浓度为 0 0 0 15 % ,灵敏度达 0 0 2 μg/带 ,染色 2h达 70 % ,4h以上或染色过夜即可充分染色 .与以往的考马斯亮蓝染色方法相比 ,该方法有经济方便、灵敏度高、几乎无背景等优点 。

用鲁米诺-过氧化氢-铜(Ⅱ)-考马斯亮蓝G250体系反相流动注射化学发光法测定铜(Ⅱ)

建立了一种Luminol-H2O2－Cu（Ⅱ）-考马斯亮蓝G250反相流动注射化学发光分析新方法，线性范围0．005－0．100mg/LCu（Ⅱ），检出限为0．0015mg/LCu（Ⅱ），对0．050mg／LCu（Ⅱ）溶液进行10次平行测定，其相对标准偏差为3．6％，干扰离子允许量大。该方法灵敏度、精密度和选择性好，直接用于江河水样中微量Cu（Ⅱ）的测定，取得了满意的结果。

G250基因siRNA表达载体的构建与鉴定

目的构建肾癌相关抗原G250小分子干扰RNA(siRNA)表达载体,通过抑制G250基因的表达,探索肾癌基因治疗的新途径。方法根据基因库上的肾癌相关抗原G250 mRNA序列,设计并合成两端含有酶切位点的75个碱基的寡核苷酸链。寡核苷酸链退火后用T4DNA连接酶连接至线性化的质粒pRNAT-U6.1/Neo中,构建成重组质粒(命名为pshRNA-G250 a,pshRNA-G250b),进行酶切及序列鉴定。结果pshRNA-G250表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA序列一致。结论成功构建pshRNA-G250表达载体,为进一步的研究及探索肾癌基因治疗奠定了基础。

考马斯亮蓝G-250染色法测定柠条锦鸡儿种子中可溶性蛋白含量

目的:建立快速、灵敏的蛋白质含量测定方法,对柠条锦鸡儿种子中可溶性蛋白质含量进行测定;方法:运用超声与研磨两种方法提取柠条锦鸡儿种子中的可溶性蛋白,采用考马斯亮蓝G-250染色法对其进行测定;结果:超声提取与研磨提取得到可溶性蛋白含量分别为6.91%、6.87%,RSD分别为0.72%0,.67%;结论:考马斯亮蓝G-250染色法简单、迅速,且两种方法提取的蛋白质含量差别不大。

G250基因沉默对肾癌786-0细胞增殖和细胞周期的影响

目的观察沉默G250基因对肾癌786-0细胞增殖和细胞周期的影响。方法构建靶向G250的siRNA表达质粒pshRNA-G250并转染肾癌786-0细胞,MTT法观察了G250基因沉默后肾癌786-0细胞(命名786-0/si-G250-a和786-0/si-G250-b)体外增殖情况,以转染空质粒的细胞(空白组,命名786-0/si-G250-0)及转染阴性对照干扰载体的细胞(阴性组,命名786-0/si-G250-n)作对照;流式细胞仪检测了786-0/si-G250-b的细胞周期,以786-0/si-G250-0作对照。结果与786-0/si-G250-0细胞及786-0/si-G250-n细胞相比,786-0/si-G250-a、786-0/si-G250-b细胞增殖速度减慢,四组差异显著(F=360.17,P=0.000);786-0/si-G250-b G0/G1期细胞比例较786-0/si-G250-0高(t=6.620,P=0.003),而S期、G2/M期细胞比例较786-0/si-G250-0低(t=4.889,P=0.008;t=6.676,P=0.003),表现出G0/G1期阻滞。结论 G250基因表达沉默抑制肾癌786-0细胞的DNA合成,将细胞阻滞于G0/G1期,肾癌786-0细胞增殖能力降低,肾癌细胞体外生长被显著抑制。

溴酸钾氧化考马斯亮蓝G250反应的催化动力学光度法测定痕量钒和亚硝酸根

建立了溴酸钾氧化考马斯亮蓝G250反应的催化动力学分光光度测定痕量钒和亚硝酸根的新方法。研究了在磷酸介质及抗坏血酸活化条件下，钒（V）强烈的催化溴酸钾氧化考马斯亮蓝G250的褪色反应，该催化反应可用于钒的测定，线性范围是0～0．4ng／mL，检出限是5．2×10^-11g／mL，催化反应的表观活化能为192．2kJ／mol，表观速率常数为3．02×10^-3s^-1，用于水样中痕量钒的测定；同一指示反应在不同的温度下，亚硝酸根也具有很高的催化活性，据此可用于亚硝酸根的测定，线性范围是0～0．4μg／mL，检出限是9．4×10^-8g／mL，催化反应的表观活化能为26．7kJ／mol，表观速率常数为1．17×10^-3s^-1，用于硝酸盐试剂中痕量亚硝酸根的测定。

G250、Ki-67和Bax在肾细胞癌组织中的表达与术后生存率的关系

目的检测G250/MN/CA(简称G250)、Ki-67和Bax在肾细胞癌及癌旁组织中的表达,探讨G250在肿瘤发展过程中的作用,以及G250、Ki-67和Bax表达对肾细胞癌患者术后生存率的影响。方法采用免疫组化SP法检测54例肾癌组织和18例癌旁组织中G250、Ki-67和Bax的表达。结果G250、Ki-67和Bax免疫染色位于肾癌细胞的细胞膜、细胞核和细胞质,三者在肾细胞癌与癌旁组织中的阳性表达差异均有统计学意义;Ki-67和Bax在肾细胞癌不同病理分级和临床分期中的阳性表达差异有统计学意义,而G250的阳性表达差异无统计学意义。随访的47例患者中,G250阳性组患者术后远期无瘤生存率低于G250阴性组,但二者间的差异无统计学意义;进一步研究表明G250阳性高表达的患者术后无瘤生存率明显高于低表达者,经Log-rank检验差异有统计学意义。Ki-67阳性组患者术后远期无瘤生存率低于Ki-67阴性组,二者间的差异无统计学意义。Bax阳性组患者术后远期无瘤生存率高于Bax阴性组,二者间的差异有统计学意义。结论G250作为一种新的肾细胞癌特异性标志物,在肾细胞癌尤其是肾透明细胞癌的诊断、筛选方面具有良好的前景,并可能影响患者的术后无瘤生存率,但其表达与肾细胞癌临床分期及病理分级无明显相关;肾细胞癌中Ki-67和Bax的表达与肾细胞癌临床分期及病理分级有明显相关性,后者的表达同时也会影响患者术后的无瘤生存率。联合检测肾细胞癌组织中G250、Ki-67和Bax的表达有利于早期诊断肾细胞癌,并有利于判断患者的预后情况,对临床工作有指导意义。

250g/L氟磺胺草醚水剂对大豆田阔叶杂草的防治效果

[目的]研究250 g/L氟磺胺草醚SL在吉林省区域内防治大豆田间杂草的效果。[方法]以250 g/L氟磺胺草醚SL为供试药剂,于2007年在吉林省大豆主产区进行大豆田除草药效试验。[结果]250 g/L氟磺胺草醚SL对大豆田一年生阔叶杂草有良好的防除效果,而且对大豆生长安全,推荐用量300.0～375.0 g/hm2。[结论]该试验为250 g/L氟磺胺草醚SL的进一步推广应用提供参考。

肾癌相关抗原G250的原核表达、纯化及抗原活性检测

目的构建原核表达质粒pET-42a-hG250,表达并纯化肾癌相关抗原G250融合蛋白,并检测G250融合蛋白的抗原活性。方法利用PCR从pGEM-T-G250质粒中扩增G250基因片段(112～1 242 bp),测序正确后将其克隆至原核表达载体pET-42a中构建重组载体pET-42a-hG250。将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,通过IPTG诱导G250蛋白的原核表达,随后将表达的融合蛋白进行纯化。经SDS-PAGE分析后,Western blot法检测纯化的蛋白,将纯化蛋白进一步包板后用ELISA对其抗原活性进行评价。结果酶切和测序结果证实pET-42a-hG250原核表达载体构建成功;转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的G250融合蛋白;Western blot法和ELISA检测证实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应,显示纯化后的G250融合蛋白具有良好的免疫原性。结论成功构建了肾癌相关抗原G250基因的原核表达载体,纯化获得了G250融合蛋白,该蛋白具有良好的抗原活性。