婴儿肥厚型心肌病一家系GAA基因的突变分析

【目的】鉴定一个婴儿肥厚型心肌病家系GAA基因的致病性突变。【方法】分析一例患病女婴的临床及家系资料;提取先证者及其父母和姐姐的外周血DNA,PCR扩增GAA基因的全部20个外显子及剪接位点序列,对PCR产物进行直接测序。【结果】家系分析表明该病的遗传方式可能为常染色体隐性遗传;心脏彩超提示患儿有肥厚型心肌病;先证者GAA基因有两个复合杂合性突变:遗传自母亲的外显子13的c.1843G>A(p.G615R)错义突变和遗传自父亲的外显子18的c.2608C>T(p.R870X)无义突变。先证者未患病的姐姐只携带了c.2608C>T杂合性突变。该两种突变均尚未在大陆地区患者中发现。该两个突变已被证实可引起突变等位基因编码的蛋白残存的GAA酶活性严重减少。【结论】GAA基因的c.1843G>A和c.2608C>T复合杂合性突变导致了该患儿出现以肥厚型心肌病为特征的经典婴儿型Pompe病(或糖原贮积症Ⅱ型)。该研究进一步证实了c.1843G>A突变与婴儿型Pompe病相关;同时也表明了对常染色体隐性遗传的婴儿肥厚型心肌病进行GAA基因检测或GAA酶活性检测的必要性。

靶向小鼠Gaa基因的CRISPR/Cas9系统设计及打靶效力分析

目的 GAA基因突变是人类II型糖原贮积病的遗传学病因,目前尚无根治方法。文章拟设计可模拟人类GAA基因强致病位点突变的靶向小鼠Gaa基因的CRISPR/Cas9系统,并在细胞水平验证其打靶效力。方法检索OMIM、ExAC以及ClinVar等数据库筛查人类Ⅱ型糖原累积病致病基因GAA的强致病位点。通过人和小鼠GAA蛋白序列比对分析将筛查到的强致病位点定位于小鼠基因组上。根据定位区域的小鼠基因组DNA序列,设计了3个向导RNA序列(Small Guide RNA,sgRNA)序列。然后构建了3个sgRNA表达载体,并将3个sgRNA表达载体分别与cas9表达质粒共转染小鼠N2a细胞。通过嘌呤霉素和杀稻瘟菌素进行药物筛选,收取阳性转染细胞。PCR扩增打靶区域DNA片段,利用T7EN I酶切反应和sanger测序初步分析打靶情况。随后通过高通量测序分析基因型和打靶效率。结果根据筛查结果判定人GAA蛋白的p.Tyr609位点为强致病位点,与小鼠Gaa蛋白的p.Tyr609位点相对应;根据小鼠Gaa蛋白p.Tyr609位点的DNA序列,成功构建了3个靶向该位点的sgRNA表达质粒;药筛阳性细胞打靶位点的PCR扩增产物测序及T7EN I酶切反应表明3个位点均发生了DNA变异;高通量测序结果表明3个位点的突变效率分别为49.45%、71.23%和70.91%。结论成功构建了靶向小鼠Gaa基因的高效CRISPR/Cas9系统,为深入研究Gaa基因的功能以及建立Gaa基因编辑小鼠模型进而探讨疾病的机制和治疗方法奠定基础。

糖原贮积病Ⅱ型1例

报告1例糖原贮积病Ⅱ型患者。患者为26岁男性,青年期表现为四肢骨骼肌萎缩无力及心肌受累,肌酶、肌电图、下肢磁共振及肌肉病理活检提示肌炎改变,外周血淋巴细胞滤纸片酶学检查显示酸性α-葡萄糖苷酶(acid alpha glucosidase,GAA)活性部分缺乏,最终检测GAA基因确诊为糖原贮积病Ⅱ型,基因变异c.-32-13T>G和c.1551+2T>G分别来自母亲、父亲。分析该患者发病特点,可认识并积累关于糖原贮积病Ⅱ型病例资料,加深对罕见的常染色体隐性遗传病理解。

谷子淀粉结合域蛋白基因家族序列特征及干旱胁迫响应表达分析

[目的]谷子属于耐旱杂粮作物,但谷子响应干旱胁迫的相关基因分子机制仍不清楚。为了明确谷子干旱胁迫是否与淀粉代谢关键酶基因相关,探索谷子抗旱的分子机制。[方法]运用生物信息学初步分析了谷子该家族基因的基本序列特征、启动子元件预测。构建该基因家族直系同源系统进化树,分析与其他物种同源蛋白的亲缘关系。基于数字基因表达谱数据分析了PEG模拟干旱条件下,该基因家族在谷子抗旱品种‘勾勾母鸡咀’和敏感性品种‘晋汾16’的表达特征。[结果]谷子全基因组调查表明该基因家族有五个成员,暂且命名为SiSBD1、SiSBD2、SiSBD3、SiSBD4和SiSBD5。序列分析表明,该基因家族成员编码的蛋白序列长度范围为360-949个氨基酸残基;蛋白分子量范围为39-108kD,蛋白质等电点为4.18-6.72。启动子元件分析鉴定出与抗旱相关的顺式作用元件,主要包含：与MYB抗旱基因调控相关,与MeJA、ETH、SA、ABA等在抗旱中起重要作用的植物激素相关,与植物防御和非生物胁迫响应相关。系统进化树表明,谷子SiSBD1基因与高粱和玉米同源蛋白SBD聚为一类,谷子SiSBD2基因与玉米SBD2、SBD3基因的聚为一类,其他3个基因归为一类。进一步分析PEG胁迫下谷子淀粉结合域蛋白基因家族表达,结果表明：SiSBD1在抗旱品种‘勾勾母鸡咀’中表达增加,在敏感性品种‘晋汾16’中表达降低,而其他4个基因的表达在这两个品种中均降低。[结论]该研究结果暗示了淀粉代谢关键酶SDB基因家族与干旱胁迫相关,可为谷子抗旱育种提供一定的理论基础。

庞贝病神经系统损伤的研究进展

庞贝病(Pompe disease)亦称糖原贮积病Ⅱ型,是常染色体隐性遗传的罕见病,随着酶替代疗法的应用,越来越多的庞贝病患者可存活至成年,以往未曾观察到的神经系统相关临床表现逐渐显现。神经系统受累严重影响庞贝病患者的生活质量,系统了解庞贝病神经系统损伤的病理变化、临床表现、影像学表现,对庞贝病的早期识别、早期干预有重要意义。该文就庞贝病神经系统损伤的研究进展进行综述。

糖原贮积病Ⅱ型GAA基因变异特点及基因型与表型的关系

目的:探讨糖原贮积病Ⅱ型患者酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因变异特点及基因型与表型的关系,并根据健康儿童GAA基因变异携带率推断理论发病率。方法:回顾性分析2010年1月至2020年5月广州市妇女儿童医疗中心确诊的18岁前起病的57例糖原贮积病Ⅱ型患者的临床资料及GAA基因分析结果,采用荧光底物法检测外周血淋巴细胞或干血斑中GAA活性,采用Sanger测序法进行GAA基因变异分析。以2395名健康儿童全外显子测序中GAA基因检测计算GAA基因变异携带率。组间率的比较采用χ2检验。结果:57例患儿中男26例,女31例。婴儿型患者28例,主要表现为进行性全身肌无力及心肌肥厚,发病年龄(2.5±1.4)月龄,确诊年龄(5.0±3.0)月龄,其中26例于1岁内死亡。晚发型患者23例,表现为肌无力、呼吸困难等,发病年龄(12.0±5.0)岁,确诊年龄(17.0±7.5)岁,7例诊断时已出现呼吸衰竭。非典型婴儿型6例,1岁左右发病,表现为肌无力伴肥厚性心肌病,诊断年龄为2.5~7.0岁。GAA基因分析显示,57例患者共检出47种变异,其中3种错义变异c.797C>T、c.1109G>A及c.1757C>T为可能致病新变异。c.1935C>A(25/114,21.9%)和c.2238G>C(15/114,13.2%)为较常见变异,57.1%(16/28)婴儿型患者检出c.1935C>A的纯合或复合杂合变异,65.2%(15/23)晚发型患者携带c.2238G>C。c.796C>T及c.1082C>T多见于非典型婴儿型。在28例婴儿型患者中,26例(92.9%)至少携带1个错义变异。健康儿童GAA基因致病变异携带率为24/2395,推测该病的理论发病率为1/40000。患者组GAA变异谱与健康儿童携带的GAA变异谱基本一致,假性缺陷变异c.1726G>A和c.2065G>A纯合子检出率在患者组分别为26.3%(15/57)和35.1%(20/57),在健康儿童组分别为1.7%(40/2395)和3.9%(94/2395),两组比较差异均有统计学意义(χ2=151.2、121.9,均P<0.01)。结论:糖原贮积病Ⅱ型临床表现呈连续的临床谱特征,少数患者为非典型婴儿型。常见的2种变异c.1935C>A和c.2238G>C分别与婴儿型及晚发型有关,c.796C>T及c.1082C>T多见于非典型婴儿型。绝大多数婴儿型患儿因携带1个错义变异推测为交叉反应性免疫物质阳性。糖原贮积病Ⅱ型理论发病率约1/40000。