GABARAP克隆表达及其抗体的制备与应用

GABARAP(GABA_A-receptor-associated protein)是最新发现的与GABA_A受体γ2亚基胞内区有相互作用的蛋白,目前的研究结果表明它可能是通过与微管相互作用辅助GABA_A受体向细胞膜上运输并使受体在膜上聚集。本文中用PCR方法扩增出编码人GABARAP(hGABARAP)的cDNA片段,然后分别克隆到真核表达载体pcDNA6/HA和谷胱甘肽转移酶(GST)融合蛋白表达载体pGEX4T2中。将后者导入大肠杆菌BL21中,经过IPTG诱导后用谷胱甘肽偶联的Sep- harose-4B柱子纯化出融合蛋白GST-hGABARAP。以此蛋白作为抗原免疫家兔制备抗GABARAP的抗血清,并用GST- hGABARAP耦联的NHS-activated Sepharose4柱子纯化抗体。纯化的抗体可以用于真核细胞中过量表达hGABARAP的Western和免疫染色检测。结果表明,过量表达的hGABARAP在真核细胞核和细胞质中都有表达,部分集中于核周区域。

中华蜜蜂GABARAP基因克隆、生物信息学分析及原核表达载体的构建

【目的】对中华蜜蜂(Apis cerana cerana)中自噬相关蛋白Atg8家族成员γ-氨基丁酸相关受体蛋白(gamma-aminobutyric acid receptor type associated protein,GABARAP)基因进行克隆鉴定和生物信息学分析,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行原核表达,以期为后续探究该基因的功能奠定基础。【方法】根据GenBank中西方蜜蜂(Apis mellifera)GABARAP基因序列(登录号:XM_001120069.5)设计引物,采用巢式PCR对中华蜜蜂GABARAP基因进行扩增、克隆;运用生物信息学软件对其氨基酸序列相似性、二级结构、三级结构进行比对和预测分析;构建GABARAP基因原核表达载体,利用Western blotting对GABARAP蛋白进行鉴定后并用IPTG诱导纯化。【结果】经巢式PCR扩增得到中华蜜蜂GABARAP基因序列;使用在线BLAST工具对氨基酸相似性进行分析显示,中华蜜蜂GABARAP与西方蜜蜂、大蜜蜂、小蜜蜂、欧洲熊蜂、东方熊蜂的氨基酸序列相似性为100%;氨基酸序列系统进化树显示,中华蜜蜂与西方蜜蜂亲缘关系最近,与秀丽隐杆线虫亲缘关系最远。生物信息学分析结果显示,GABARAP基因编码区全长354 bp,编码117个氨基酸,蛋白分子质量为13.99 ku,理论等电点为9.48;GABARAP蛋白二级结构主要由3个α-螺旋、4个β-折叠和6个多肽结合位点构成,二、三级结构预测结果一致;SDS-PAGE分析结果显示,IPTG诱导的GABARAP蛋白分子质量为35 ku;Western blotting鉴定结果证明了His单克隆抗体可以特异性识别GABARAP蛋白。【结论】本研究成功克隆了中华蜜蜂GABARAP基因,获得了GABARAP蛋白并进行了生物信息学分析,为进一步研究GABARAP基因及其蛋白在自噬发生中的作用提供了参考。

水杨酸钠诱发大鼠听皮层中GABARAP表达的改变

目的通过检测水杨酸钠诱导耳鸣大鼠听皮层中GABAA受体相关蛋白(GABAA receptor-associated protein,GABARAP)转运蛋白的表达,研究耳鸣大鼠听皮层是否出现GABARAP蛋白表达的改变,探讨GABARAP在耳鸣中的作用机制。方法126只SD大鼠,随机等分成7组:对照注射、慢性注射7天组;对照注射、慢性注射14天组;停药后恢复3天组、7天组及14天组。前脉冲抑制(PPI)实验评价动物能否产生耳鸣样行为。实时荧光定量PCR检测听皮层中GABARAP mRNA表达。Western Blot检测听皮层中GABARAP蛋白表达。免疫组化检测听皮层中GABARAP荧光表达。结果(1)长期注射水杨酸钠后,大鼠前脉冲抑制率升高,差异有统计学意义(P<0.05);(2)慢性注射7天组、14天组及停药后恢复3天组、7天组、14天组,GABARAP mRNA表达较对照组没有统计学差异(P>0.05);(3)慢性注射7天组、慢性注射14天组,GABARAP蛋白表达水平较对照组升高,差异有统计学意(P=0.037,P=0.000,P<0.05);(4)慢性注射7天组、慢性注射14天组,GABARAP荧光表达水平较对照组升高,差异有统计学意义(P=0.008,P=0.000,P<0.05)。结论耳鸣模型大鼠听皮层中GABARAP变化可能是导致大鼠耳鸣的机制之一。

细胞自噬在脂氧素A4治疗大鼠脊髓缺血再灌注损伤中的作用

目的脂氧素A4(LXA4)在大鼠脊髓缺血再灌注损伤中已被证实具有良好的保护作用,细胞自噬是否是其保护作用机制之一仍不明确。文章拟讨论细胞自噬在LXA4治疗大鼠脊髓缺血再灌注损伤中的作用。方法48只大鼠以随机数字表法分为LXA4组、缺血再灌注组、假手术组,每组16只,假手术组仅暴露腹主动脉,其他两组构建脊髓缺血再灌注损伤模型,LXA4组:在关腹后30 min脊髓鞘内注射10μL LXA4(300 pmol);缺血再灌注组:在关腹后30 min脊髓鞘内注射等渗盐水(0.1 mL/kg);假手术组:不注射药物。3组大鼠分别于再灌注24 h后颈椎脱臼法处死,处死后取出腰段脊髓。LC3B荧光染色法对3组大鼠的脊髓组织进行染色并计数,Western blot检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、γ-氨基丁酸受体A相关蛋白(GABARAP)的表达。结果假手术组LC3B阳性细胞较少,缺血再灌注组(399.80±18.46)和LXA4组(240.80±12.76)的LC3B阳性细胞数较假手术组(73.40±19.42)明显升高(P<0.05),LXA4组较缺血再灌注组阳性细胞数明显减少(P<0.05)。缺血再灌注组及LXA4组大鼠的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、GABARAP的表达较对照组明显增高(P<0.05);与缺血再灌注组比较,LXA4组脊髓组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明显下降(P<0.05)。结论当SCII发生后,激活了细胞自噬,说明细胞自噬参与了SCII发生的过程;给予LXA4后,细胞自噬被抑制,脊髓缺血再灌注损伤缓解。

达氏鲟自噬基因MAP1LC3B克隆及其组织表达分析

【目的】掌握达氏鲟微管相关蛋白1A/1B轻链3B基因(MAP1LC3B)的表达模式,为后续研究MAP1LC3B基因功能及揭示达氏鲟的抗病分子机制提供理论依据。【方法】采用RACE技术从达氏鲟组织中克隆MAP1LC3B基因,通过ProtParam、TMpred、Phyre2及Singal 4.1等在线软件进行生物信息学分析,同时借助实时荧光定量PCR检测MAP1LC3B基因在达氏鲟不同组织中的表达情况。【结果】达氏鲟MAP1LC3B基因cDNA序列全长2208 bp,包含378bp的开放阅读框(ORF)、202 bp的5’端非编码区(5’-UTR)和1628 bp的3’端非编码区(3’-UTR),编码125个氨基酸。MAP1LC3B氨基酸序列含有GABARAP泛素结构域、Agt7结合位点、脂化位点和维管束蛋白结合位点。达氏鲟MAP1LC3B蛋白由18种氨基酸组成,其中谷氨酸(Glu)含量最高(占9.6%)、丙氨酸(Ala)含量最低(占1.6%);蛋白分子量为14743.01 Da,理论等电点(pI)为8.92,不稳定系数为65.12,总平均亲水性为-0.484,是一种不稳定的疏水性蛋白,且不存在跨膜结构,也无信号肽序列。MAP1LC3B基因在达氏鲟鳃、脑、皮肤、头肾、前肾、脾脏、中肾、心脏和肠道等组织中均有表达,以在鳃和肠道组织中的相对表达量较高,显著高于在其他组织中的相对表达量(P<0.05)。【结论】达氏鲟MAP1LC3B基因具有较高的保守性,在鳃和肠道黏膜免疫组织中高表达,表明自噬参与达氏鲟黏膜免疫过程,调节机体免疫反应。

低盐胁迫下三疣梭子蟹γ-氨基丁酸及其A型受体相关蛋白对渗透压调节的影响

为探究低盐胁迫下γ-氨基丁酸(GABA)及其A型受体相关蛋白(GABARAP)在三疣梭子蟹渗透压调节过程中起到的作用,实验检测了低盐度10条件下,三疣梭子蟹在0, 3, 6, 9, 12, 24, 36,48 h的血清渗透压、血清氯离子(Cl-)浓度等指标,同时对鳃组织的GABA量以及GABARAP基因表达量变化进行测定.结果显示,血清渗透压和血清Cl-浓度在12 h内显著下降(P<0.05), 12 h后趋于稳定;相对0 h,血清Cl-浓度降低17.93%,血清渗透压降低24.46%,与外界海水渗透压的差值维持在(183.21±9.51)mOsm·kg^(-1). GABA量及GABARAP基因表达量波动上升, 12 h后基本维持稳定.研究结果表明,三疣梭子蟹对低盐度条件的适应性调节在12 h内进行,之后基本维持稳定,GABA量以及GABARAP基因表达量在此过程中呈现显著的正相关关系,对血清Cl-浓度的调节起到了重要作用,使得12 h后血清渗透压与外界海水渗透压维持在(183.21±9.51)mOsm·kg^(-1),保证各项生理活动的正常进行.

西罗莫司和饥饿处理对人A431细胞自噬水平的影响

目的：探讨经典自噬诱导剂西罗莫司和饥饿处理对人皮肤鳞状细胞癌细胞系A431自噬水平的影响。方法分别将A431细胞和人宫颈癌细胞系HeLa分为对照组（单纯DMEM培养基处理）、二甲基亚砜（DMSO）组、20 nmol/L西罗莫司组、80 nmol/L西罗莫司组、平衡盐溶液（EBSS）组。作用4 h后，Western印迹检测A431细胞和HeLa细胞自噬微管相关蛋白轻链3A/3B（LC3A/B）、重组人γ-氨基丁酸受体相关蛋白（GABARAP）的表达水平。吖啶橙染色分析细胞自噬体表达水平。结果 Western印迹检测显示，对照组与DMSO组A431细胞中LC3A/B-Ⅱ与LC3 A/B-Ⅰ比值差异无统计学意义（P〉0.05）；20 nmol/L西罗莫司组、80 nmol/L西罗莫司组、EBSS组LC3 A/B-Ⅱ与LC3 A/B-Ⅰ比值较对照组均明显升高，差异均有统计学意义（P〈0.05）。HeLa细胞Western印迹检测结果与A431细胞类似。双变量相关性分析显示，HeLa细胞中LC3A/B-Ⅰ与GABARAP表达呈正相关（r=0.869，95%CI：0.807~0.999，P=0.051），LC3A/B-Ⅱ与GABARAP表达呈负相关（r=-0.742，95%CI：-0.982~0.406，P=0.042）；A431细胞中LC3A/B-Ⅰ与GABARAP表达亦呈正相关（r=0.837，95%CI：-0.173~0.989，P=0.037），LC3A/B-Ⅱ与GABARAP表达呈负相关（r=-0.684，95%CI：-0.977~0.500，P=0.047）。吖啶橙染色显示，A431细胞自噬阳性细胞比例在西罗莫司组（23.750%±0.260%）与EBSS组（32.450%±0.488%）同样高于对照组（15.987%±0.242%，均P 〈0.05）；HeLa细胞自噬阳性细胞比例在西罗莫司组（33.307%±0.715%）和EBSS组（66.097%±1.141%）高于对照组（14.117%±0.295%，均P〈0.05）。结论经典自噬诱导剂西罗莫司和饥饿能够上调A431细胞的自噬水平，GABARAP蛋白可能与LC3A/B高度相关。

ATG8家族蛋白的研究进展

自噬是细胞或者有机体在营养缺乏等环境应激条件下,通过在细胞里产生双层膜自噬体,包裹细胞质或受损伤的细胞器等,将它们运送到溶酶体或液泡中进行降解,维持细胞稳态平衡的重要生物学过程。ATG8是自噬过程中的一个关键蛋白,然而ATG8和自噬、自噬和癌症之间的联系仍不清楚。该文总结了ATG8在自噬的激活、自噬小体成熟以及自噬体与溶酶体融合等自噬过程中的作用,并讨论ATG8蛋白在癌症过程中的促肿瘤和抗肿瘤作用以及在其他疾病中的最新研究进展,为未来开发针对癌症自噬过程的新的抗癌疗法提供参考。

血管紧张素Ⅱ1型受体相关蛋白研究进展

血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)作为肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)的关键效应因子,与血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor,AT1R)结合后,在体内发挥维持体液及电解质平衡、收缩血管、调节血压,促进心肌、肾近端小管以及血管平滑肌细胞增殖,参与肿瘤的发生发展、血管形成和转移等重要作用。最新研究发现,AT1R相关蛋白特异性作用于AT1R蛋白的碳末端,通过调节受体的内化、细胞膜的再通和受体的敏感性对其表达进行控制,发挥相应的生物学作用。本文的重点在于对AT1R相关蛋白的研究进展进行综述,阐述不同AT1R相关蛋白在RAS系统中所起的作用,为RAS系统的进一步研究提供依据。