基因枪法将GAI基因导入巴西橡胶的研究

为了探讨利用基因工程技术进行橡胶树品质改良的可行性,用基因枪轰击巴西橡胶(Hevea brasiliensis)愈伤组织,将GAI矮化基因导入橡胶受体中,通过50mg L-1卡那霉素筛选鉴定,优化了基因枪法转化橡胶的各种参数。结果表明,DNA金弹与靶细胞的距离为9cm,每皿轰击一次时,胚状体诱导率可以达到1.87%。经过GUS组织染色和PCR扩增鉴定,初步确定GAI基因已经整合到橡胶基因组中。

基因枪法获得GAI转基因橡胶树植株的研究

将含有Camv35S启动子、卡那霉素抗性基因和GUS报告基因,目的基因为GAI基因的转化载体质粒pBI121,通过基因枪轰击巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell.-Arg.)花药愈伤组织,50 mg L-1卡那霉素的继代培养基进行抗性筛选。获得了抗性再生植株,经过PCR、Southern检测结果表明:GAI基因已经成功转入橡胶树基因组中。

蓖麻DELLA蛋白家族GAI基因克隆、表达及生物信息学分析

植物激素赤霉素对植物生长发育具有多种调控功能,赤霉素信号转导途径依赖DELLA蛋白介导.为探究DELLA蛋白家族成员在蓖麻植株生长过程中所起到的作用,实验以通蓖5号蓖麻品种为实验材料,利用蓖麻基因组及转录组数据,筛选DELLA蛋白家族成员关键成员GAI.PCR扩增获取GAI基因全长cDNA序列,测序结果表明,通蓖5号GAI基因序列与GenBank已发表的Hale品种GAI(登录号:XM_002533984.2)基因序列相比较,在第871位置处有一个单核苷酸改变(G→A),但其编码的氨基酸未见改变.生物信息学序列分析发现蓖麻GAI蛋白具有GRAS家族典型的结构域.系统发育树分析表明,DELLA GAI蛋白在物种进化过程中具有高度保守性.实验比较了通蓖5号成熟种子、新鲜叶片、根尖和茎尖组织材料,RT-PCR比较蓖麻不同组织器官的GAI基因的条带相对百分比.结果表明,GAI基因表达量在不同组织器官中存在显著差异,GAI基因在蓖麻中的表达量从小到大依次为:成熟种子﹤新鲜叶片﹤根尖﹤茎尖,这可能是GAI基因在蓖麻不同的组织器官中发挥着不同的作用有关,GAI蛋白可能与茎尖发育、蓖麻株高具有显著相关性.

BvM14-GAI基因的克隆及亚细胞定位

GAI蛋白属于GRAS家族中的DELLA亚家族,参与植物发育、光合、抗逆等重要的植物生长过程。实验室前期在盐胁迫的转录组数据中发现甜菜M14品系GAI基因(BvM14-GAI)受盐胁迫上调表达,为了进行该基因生物学功能的研究,本研究以甜菜M14品系为材料,通过PCR技术获得BvM14-GAI基因cDNA全长序列,并进行生物信息学以及亚细胞定位分析。研究成功获得了BvM14-GAI基因cDNA序列;生物信息学分析显示,BvM14-GAI基因开放阅读框为1824 bp(包括终止密码子),编码607个氨基酸,理论分子量为66 kDa,等电点为5.37;蛋白多重序列比对和系统进化树分析显示,BvM14-GAI蛋白与菠菜(Spinacia oleracea)和藜麦(Chenopodium quinoa)中GAI蛋白亲缘关系最近;亚细胞定位预测显示定位在细胞核。进一步将BvM14-GAI基因与pCAMIA2300-eYFP载体重组,构建亚细胞定位载体,利用冻融法转化农杆菌EHA105,进行烟草注射,结果显示BvM14-GAI蛋白定位在细胞核。本研究成功获得BvM14-GAI基因的cDNA全长,并确定该基因的烟草亚细胞定位在细胞核中,结果为后续该基因功能的研究提供了重要参考。

转录因子BvM14-GAI耐盐功能研究

转录因子在植物应答逆境胁迫过程中发挥着重要作用,GAI蛋白是植物转录因子家族的重要一员,对其研究主要集中在光响应机制领域,而该蛋白响应耐盐机制研究报道较少。实验室前期已经获得甜菜M14品系盐胁迫转录组中上调表达基因BvM14-GAI的cDNA全长,本研究试图阐明该基因参与盐胁迫的功能。通过构建该基因植物表达载体,利用农杆菌介导花序浸染法转化拟南芥野生型和GAI基因突变株,检测150 mmol/L NaCl胁迫下异源表达和异源互补拟南芥植株的表型和生理生化指标。0 mmol/L NaCl处理时,以拟南芥野生型和GAI基因突变株为对照,异源表达和异源互补植株的根长、鲜重和干重均显著低于对照,说明BvM14-GAI基因为生长负调控因子;150 mmol/L NaCl胁迫处理后的根长、鲜重、干重及K+/Na+差异不显著,但甜菜碱、SOD和POD酶活性的含量显著增加,表明转录因子BvM14-GAI通过增强渗透调节和抗氧化酶系统提高异源表达和异源互补拟南芥植株的耐盐功能。研究结果不仅拓展了植物GAI基因响应非生物胁迫的功能,而且对阐明甜菜M14品系耐盐分子机制和培育耐盐作物品系具有一定研究价值。

5种苹果属植物GAI基因的克隆及生物信息学分析

【目的】研究DELLA家族的成员GAI在调控植物株型形成方面的生物学功能。【方法】从5种苹果属植物(‘国光’、‘武乡海棠’、‘SH6’、‘比利时垂枝’、‘比利时直立’)中分离得到GAI基因,应用多种生物学工具分析其序列特征。【结果】序列分析表明,GAI的CDS序列长度为1 875bp,编码624个氨基酸;GAI的基因组序列长度与其对应CDS序列长度相同;GAI蛋白具有亲水性,主要定位于细胞质;5种苹果属植物的GAI序列相似性极高,都具有DELLA家族和GRAS家族特有的典型结构。【结论】试验结果暗示这5种苹果属GAI基因可能在苹果株型形成方面发挥重要功能。

农杆菌介导法遗传转化巴西橡胶树转化条件的研究

用包含GAI基因的EHA105农杆菌,对巴西橡胶树海垦2花药愈伤组织进行侵染,对多项转化条件进行了梯度实验,结果表明选择培养30 d的橡胶花药愈伤组织,农杆菌菌液浓度OD600为0.6时侵染3 min,20℃共培养2 d,Cef浓度为200 mg/L进行抑菌培养是比较合理的转化条件。

黄毛草莓编码NB-ARC结构域的FnCN基因和启动子克隆及FnCN基因表达分析

利用同源克隆技术得到黄毛草莓(Fragaria nilgerrensis Schlecht.ex Gay)中编码NB-ARC结构域的抗病相关基因FnCN及启动子序列。序列分析结果表明:FnCN基因开放阅读框的长度为933 bp(GenBank登录号MN240290),编码310个氨基酸残基,其N端有1个Rx-CC结构域,C端有1个保守的NB-ARC结构域。该基因起始密码子上游启动子pFnCN序列的长度为910 bp(GenBank登录号MN240291),包含TATA-box、CAAT-box、激素响应元件、干旱诱导MYB结合位点、光响应元件和厌氧诱导顺式作用元件等。氨基酸序列的同源性比对结果表明:黄毛草莓FnCN基因与野草莓(Fragaria vesca Linn.)CN基因编码氨基酸序列的相似性最高(95.16%)。成功构建了黄毛草莓FnCN基因的植物过表达载体pCAMBIA1301-HA-FnCN和病毒诱导基因沉默载体pTRV2-FnCN。实时荧光定量PCR检测结果表明:黄毛草莓叶片接种胶孢炭疽菌〔Colletotrichum gloeosporioides(Penz.)Sacc.〕后0~3 h FnCN基因表达下调,之后逐渐上调;接种后48 h该基因的相对表达量最高,是接种后0 h的3.3倍。研究结果显示:黄毛草莓FnCN基因响应胶孢炭疽菌的胁迫,推测其在黄毛草莓抗炭疽病过程中发挥着重要作用。

芒果DELLA-GAI基因及其启动子的克隆与分析

DELLA蛋白是赤霉素(GA)代谢通路中的受体因子,参与了数种环境信号、激素信号的系统反应。本研究采用同源克隆的手段,参考NCBI登录的‘阿方索’芒果的基因组数据,克隆了‘贵妃’芒果的DELLAGAI基因。其全长cDNA序列长2120 bp,包含一个1719 bp的开放阅读框(ORF),编码572个氨基酸,蛋白分子量为62.9 kD,等电点为5.10。由系统进化树分析可知,可可、榴莲、番木瓜、木薯等作物与该基因编码的蛋白聚为一类。经互作蛋白分析发现,芒果DELLA-GAI可能与GID1B、GID1C、SLY1、PIF4、JAZ1、GA3OX1等蛋白存在相互作用。启动子结构分析发现,该启动子主要含有MYB响应元件、光响应元件、植物抗病相关元件、MYC响应元件、MYB识别位点以及脱落酸和水杨酸响应元件。通过检测DELLA-GAI基因在‘贵妃’芒果果实不同发育阶段的表达情况发现,其在果实成熟期和完全成熟期表达量比较高,而在幼果期的表达量比较低。该基因及其启动子的研究与分析为探究‘贵妃’芒果果实色泽及其抗逆境调控机制提供了条件。

黄毛草莓FnERF017基因和启动子克隆及表达分析

ERF在植物的生长发育和生物胁迫响应中起着重要作用。为进一步研究草莓ERF基因的功能,以黄毛草莓叶片为材料,通过RT-PCR技术克隆获得1个FnERF017基因。基因序列及分子特征分析结果表明,FnERF017基因的cDNA全长序列为651 bp,编码216个氨基酸,具有一个AP2/ERF保守结构域,其编码产物为亲水性不稳定蛋白;聚类分析结果显示,黄毛草莓FnERF017蛋白与森林草莓的ERF蛋白具有高度同源性;胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporiodes)胁迫表达特征分析表明,Fn ERF017在胶孢炭疽菌胁迫条件下呈上调表达,表明其正向响应胶孢炭疽菌胁迫;上游启动子顺式作用元件预测显示,启动子pFnERF107序列中含有胁迫响应元件及激素响应元件等多种类型的顺式作用元件。研究结果为进一步研究FnERF017的基因功能提供基础。