管家基因GAPDH与肝癌患者诊断及预后的生物信息学分析

目的探究管家基因GAPDH能否有效诊断肝癌患者并影响其生存预后。方法利用TCGA、GEO等生物信息学数据库,检测GAPDH在肝癌中的表达;利用K-M plotter数据库,验证GAPDH与肝癌患者生存预后的关联;利用DAVID、TIMER数据库,探究GAPDH影响患者生存预后的相关机制。结果GAPDH在肝癌中表达升高,是一个影响肝癌患者总生存期和无复发生存期的独立危险因素。GAPDH可能通过调控糖酵解过程、缺氧诱导因子-1相关信号通路和免疫细胞浸润来影响患者生存率。结论GAPDH是一个潜在的肝癌诊断指标和预后影响因素。

三七植物GAPDH基因克隆及序列分析

采用改进的异硫氰酸胍法提取高质量三七总RNA,运用RT-PCR方法克隆了三七GAPDH基因的部分序列,长度为627 bp,编码209个氨基酸,为半定量RT-PCR以及Real-time RT-PCR等技术在三七植物研究中的应用提供了条件.氨基酸序列比对结果表明,该序列与拟南芥、烟草、人参的GAPDH氨基酸序列的同源性分别为91%、93%、95%;核苷酸序列的同源性分别为82%、84%、85%.

金黄色葡萄球菌重组GapC蛋白的GAPDH活性及免疫原性分析

为研究金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)表面GapC蛋白的GAPDH活性、免疫原性及免疫保护作用,应用PCR方法扩增出S.aureus的gapC基因,插入到pQE-30载体相应位点,构建重组质粒pQE/gapC。将其导入宿主菌E.coliM15(pREP4)后,IPTG诱导表达。重组蛋白纯化后进行GAPDH活性检测,并与灭活全菌体分别免疫健康家兔。然后,应用ELISA方法检测血清中IgG抗体水平及IFN-γ、IL-4细胞因子浓度,并用1.0×108CFU/mLS.aureus菌株Wood46对免疫家兔攻毒。SDS-PAGE结果显示,GapC蛋白在E.coliM15(pREP4)中获得表达;经GAPDH活性检测及WesternBlot检测,重组蛋白具有较高的GAPDH活性和抗原特异性;经ELISA检测,GapC蛋白及全菌体组兔血清中IgG抗体水平迅速升高,并在加强免疫后第28天达到最高(1:64000),加强免疫后第14d,血清中细胞因子IFN-γ和IL-4浓度与对照组相比,显著升高(P<0.05),而全菌体免疫组升高不明显(P>0.05);攻毒结果为蛋白免疫组家兔获得一定的免疫保护(4/5)。以上结果表明,表达的重组GapC蛋白具有GAPDH活性、较好的免疫原性及免疫保护力,可作为深入研究S.aureus基因工程疫苗的良好靶向。

脊尾白虾GAPDH基因的克隆及其内参基因稳定性分析

为比较甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、18S rRNA和β-actin基因在脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)作内参基因的优劣,本研究采用同源克隆和RACE技术,克隆了脊尾白虾GAPDH基因全长cDNA序列(GenBank登录号:KX893516),通过实时荧光定量PCR(quantative real-time PCR,qPT-PCR)技术,检测3种基因在脊尾白虾不同组织及不同蜕壳后时间点的表达量变化,在此基础上进行内参稳定性分析。结果显示,脊尾白虾GAPDH基因全长1514 bp,开放读码框1002 bp,编码333个氨基酸,二级结构预测显示GAPDH蛋白具有一个高度保守的NAD^+结合功能域(NAD binding domain)和行使糖运输和代谢的催化功能域。分析qRT-PCR结果并结合ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 3种软件的分析发现,在不同组织和不同蜕壳后时间点,3种内参基因的稳定性由高到低依次为18S r RNA、GAPDH、β-actin。因此,在脊尾白虾不同组织和不同蜕壳后时间点的定量分析中,选取单内参基因时,推荐使用18S rRNA为内参基因,双内参时推荐18S rRNA和GAPDH,而18S rRNA、β-actin和GAPDH在其他生理条件下作内参基因的稳定性还有待进一步研究。

杧果MGAPDH同源基因的克隆及其表达分析

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)是糖代谢和能量代谢过程中的关键酶。根据GAPDH基因保守序列设计PCR引物,利用RT-PCR和改良RACE技术,首次从杧果中分离克隆出MGAPDH同源基因的cDNA全长序列。该序列全长为1 356 bp,开放阅读框为1 203 bp,编码401个氨基酸。利用分子生物学软件对MGAPDH蛋白进行生物信息学分析,结果显示:MGAPDH蛋白分子量为42.8 ku,等电点为8.9;该蛋白包含2个功能域,即NADB_Rossmannsuperfamily和Gp_dh_C superfamily;MGAPDH蛋白不含信号肽序列和跨膜结构,是非分泌蛋白,位于叶绿体中。氨基酸序列进化分析结果显示,杧果MGAPDH蛋白可能与光合作用有关。半定量分析显示,杧果MGAPDH同源基因在杧果不同组织中均表达,并且表达水平差异不明显,说明杧果MGAPDH同源基因可作为杧果基因差异表达的内参基因。

食蚊鱼(Gambusia afinis)cat、gapdh和gst基因的克隆及其在生态毒理学中的应用

根据Ensembl、Genbank登录的鱼类cat、gapdh和gst基因的CDS序列设计普通PCR扩增引物,寻找食蚊鱼的cat、gapdh和gst基因的c DNA片段,并根据定量引物设计要求设计出相应的SYBR Green I荧光定量RT-q PCR引物,建立了食蚊鱼cat、gapdh和gst基因的SYBR Green I荧光定量RT-q PCR方法。该方法在104~108数量级范围内有良好线性关系(R=0.999~1.000);熔解曲线显示扩增产物特异性良好,均为单一峰值;质粒标准品最高浓度与最低浓度的批内试验变异系数与批间试验变异系数均低于2%。利用该方法监测和评价环境污染物对水生生物的影响,选择了水体中常见典型药物污染物——双氯芬酸,研究其对食蚊鱼抗氧化基因表达的影响。结果表明,雌性食蚊鱼暴露在不同浓度双氯芬酸钠(0.005、0.05、0.5和5 mg·L-1)24 h后,其肝脏cat、gapdh和gst的mRNA呈现显著变化,相对于对照组,在低浓度0.005 mg·L-1时,cat与gst mRNA的表达量均有极显著上升(p<0.01),而其它浓度均极显著下降(p<0.01)。试验表明该方法具有快速、精确、灵敏度高的优点,可为利用该类小型鱼类的原位污染物的生物监测和生态毒理评价提供有力的技术支持。

鸭GAPDH基因实时荧光定量PCR方法的建立

本研究旨在建立鸭GAPDH基因的real-time PCR技术,为鸭功能基因mRNA水平的定量分析提供有用的方法学基础.根据GenBank中鸭GAPDH基因的序列设计引物,建立了基于SYBR Green I染料技术的real-time PCR方法.结果表明,所建立的方法具有快速、高通量、线性范围广以及重复性强等特点.研究结果为鸭GAPDH作为内参基因用于鸭相关基因定量表达分析奠定了基础.

S29、18S rRNA和GAPDH基因在肺肿瘤组织中表达的比较

目的 分析小核糖体亚基S2 9、18SrRNA和甘油醛 3 磷酸脱氢酶 (GAPDH)三种基因在手术切除的人肺肿瘤组织中的表达水平并作比较。方法 Northern分子杂交 ,结果采用密度扫描进行分析。结果 发现GAPDH基因在肺肿瘤组织 (包括良性肿瘤 )中表达调高 ,而S2 9基因和 18SrRNA基因的表达水平没有明显变化。结论 在分析肿瘤的基因表达状况时 ,不应用GAPDH作为标定mRNA量的内参照 ,而应当同时研究组织和培养细胞两方面。GAPDH的表达调高可能是肿瘤发生的一个指征。

中国美利奴羊(新疆型)皮肤组织GAPDH基因实时荧光定量PCR方法的建立

【目的】建立GAPDH内参基因实时荧光定量PCR方法,为进一步研究中国美利奴羊(新疆型)相关基因的定量表达奠定基础。【方法】采用中国美利奴羊(新疆型)皮肤组织为试材,根据Genebank中绵羊GAPDH基因序列,设计并合成一对引物,建立基于SYBR Green I染料技术的Real-Time PCR检测体系,绘制出标准曲线并对其熔解曲线分析。【结果】以cDNA为模板建立的标准曲线循环阈值(Ct)与标准cDNA模板在一定浓度范围内呈良好的线性关系,GAPDH基因标准曲线中模板拷贝数(X)与Ct值的关系为Ct=一3.679 51g/X+35.648,相关系数R=0.999 8;试验重复性好,批内和批间变异系数(CV%)分别为0.22%～3.45%和1.30%～4.89%。【结论】所建立的方法具有快速、线性范围广、重复性强等特点,GAPDH可作为内参基因用于绵羊相关基因的定量表达研究。

小麦GAPDH基因克隆及序列分析

采用Trizol法提取高质量小麦总RNA,并运用RT-PCR方法克隆了小麦GAPDH(甘油醛三磷酸脱氢酶)基因的部分序列(EU022331),长度为604bp,核苷酸序列比对结果表明,该序列与大麦(M36650)、玉米(AY109397)、番茄(BT012693)GAPDH核苷酸序列的同源性分别为95%、86%和84%。GAPDH基因的克隆为在禾谷类作物研究的应用提供了一个较好的对照基因。

家兔GAPDH基因实时荧光定量RT-PCR方法的建立

根据GenBank登录的家兔GAPDH基因保守区域CDS序列设计1对引物,通过反应体系及反应条件优化,成功建立了检测家兔GAPDH基因的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法。结果表明,该方法检测GAPDH的最低拷贝数为32拷贝/μL,在较广的范围内（3.2×10^1-3.2×10^7拷贝/μL）有良好的线性关系（r=0.999）;熔解曲线分析显示扩增产物的特异性单峰,其Tm为（87±0.2）℃;5个不同浓度标准品组内试验变异系数为1.67%4.73%,组间试验变异系数为2.66%8.74%。该方法具有快速、灵敏、高通量及可重复性强等优点,为GAPDH基因作为内参基因进行家兔功能基因与病原基因表达的定量分析提供了方法学基础。

赤桉GAPDH家族基因的克隆及其序列分析

甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）是高等植物糖酵解和糖异生反应中的关键酶，是维持生命活动能量形成的最基本酶之一，它氧化甘油醛-3-磷酸生成1，3-二磷酸甘油酸，由此为糖酵解过程提供产生ATP的底物[1-4]。此外，由于该酶基因为管家基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或组织中的蛋白质表达量较为恒定，故被广泛用作实时荧光定量PCR的内参基因[5-9]。近年来，随着研究的不断深入，发现GAPDH还参与胚胎的特化、细胞融合、微管结束、磷酸转移酶激活、DNA复制与修复等过程，并调控组蛋白基因的表达、调节端粒结构，具有核膜融合和微管成束的活性[10-14]。同时，GAPDH的mRNA和蛋白质水平会受到各种环境因素的影响，并具有不同的亚细胞定位以及多元化的生理功能[15-16]。

大鼠死后脑组织GAPDH mRNA多位点降解与晚期死亡时间的关系研究

目的探讨看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA上不同位点降解速率的规律性及其用于晚期死亡时间推断的可行性。方法选取在死后较长时间内仍能检测出扩增产物的大鼠脑顶叶皮质,对GAPDH mRNA的6个不同位点进行不同时间点(死后即刻、1d、5d、9d、12d)的实时荧光定量RT-PCR监测,这些位点依次分布于GAPDH mRNA的5′～3′端。结果用Ct值表示,并将所得数据及其比值(GAPDH mRNA1～GAPDH mRNA5与GAPDH mRNA6的比值)与死亡时间(PMI)进行线性回归分析。结果各位点GAPDH mRNA均与死后经过时间有相关性,但不同位点的mRNA降解速率不同。GAPDH mRNA1～GAPDH mRNA3的斜率为1.577、1.596、1.553,这3个位点的降解速率基本相同。GAPDH mRNA4～GAPDH mRNA6的斜率为0.936、0.892、0.829,这3个位点的降解速率基本相同。但后3个位点mRNA的降解速率要慢于前3个位点(P<0.05)。以GAPDH mRNA6作为外标,GAPDH mRNA1～GAPDH mRNA3与其的比值同PMI之间有相关性(R2=0.898,0.871,0.879),而GAPDH mRNA4和GAPDH mRNA5与其的比值同PMI之间无相关性。结论同一组织中看家基因GAPDH的不同位点存在降解速率的差异性。选取降解速率慢的靠近3′端的位点作为引物,可能更适于研究晚期死亡时间的推断。

文心兰GAPDH基因片段的克隆及序列分析

采用Trizol法提取文心兰花期花葶总RNA,并运用RT-PCR方法克隆了文心兰GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)基因的2个部分序列,长度均为875 bp,编码291个氨基酸残基.序列分析结果表明,与其它已登录物种的GAPDH基因相比,其核苷酸序列的同源性均在79%以上,与蕙兰(JN177724.1)同源性高达到92%,氨基酸序列的同源性也在85%以上;且与单子叶植物的同源序列表现出较高的相似性.本研究已克隆出文心兰GAPDH基因的部分cDNA同源序列片段,分别命名为OnGA1和OnGA2,并在GenBank注册,登录号分别为JN981141和JN981142.

擎天凤梨GAPDH基因的克隆及序列分析

管家基因GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)常被用作定量、半定量PCR试验的内参,以确定目标基因的相对表达量。基于前期从全长cDNA文库中获得GAPDH基因的EST单克隆,进行PrimerWalking测序,获得一个GAPDH的全长cDNA序列,序列长1 790 bp,编码421个蛋白氨基酸,命名为GoGAP-DH1。采用Blast,ExPASy,ProtParam,SPOMA,Find Conserved Domains(NCBI),ClustalX,MEGA等生物信息学软件对cDNA序列、氨基酸序列、保守区、亲缘关系等特征进行分析。结果表明,GoGAPDH1与玉米的细胞质GAPDH基因源性最高,为82%。初步推断GoGAPDH1可能是一个胞质型GAPDH。

实时荧光PCR检测鸡GAPDH基因方法的建立

根据GenBank上鸡的3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehy-drogenase,GAPDH)基因的序列,在保守区域设计并合成一对引物,采用SYBR GreenⅠ染料建立了荧光定量PCR法。采用梯度浓度的GAPDH基因重组标准品质粒DNA进行荧光定量PCR并建立了标准曲线,经分析显示标准曲线的Ct值与标准品浓度的对数值之间存在良好的线性关系;动力学曲线分析表明,在本研究所建立的反应体系和反应条件下,标准曲线的灵敏度都达到10拷贝/反应。实时荧光定量PCR检测GAPDH基因表达水平标准品质粒和标准曲线的建立,为GAPDH基因作为内参基因进行鸡功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础。

GAPDH功能多样性

3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一直以来被认为是一种只分布在细胞质中、仅在糖酵解过程中起关键作用的酶。但是近年来,越来越多的研究表明GAPDH是一种多功能蛋白,且在细胞核、细胞质、生物膜上均有定位。如在细胞核内,GAPDH参与tRNA出核、mRNA稳定性调节、DNA损伤修复、组蛋白转录调控、凋亡及神经退行性疾病发生等。在细胞质中,GAPDH有磷酸激酶活性、催化微管聚合的功能及参与细胞保护。在生物膜上,GAP-DH可促进膜融合、参与膜转运等。

Taqman荧光定量PCR是核酸水平对管家基因GAPDH进行定量的好方法

目的 比较Taqman荧光定量PCR法、SYBR GreenⅠ荧光定量PCR法和普通PCR法制作3-磷酸甘油醛（GAPDH）标准曲线的检出下限、线性范围的差异，确定一种较好的GAPDH绝对定量方法。方法 构建含GAPDH全长的质粒，经PCR和EcoRⅠ限制性酶切鉴定确认后，紫外定量并连续稀释10倍作为标准品。分别用Taqman法和SYBR GreenⅠ法于荧光定量PCR仪上制作标准曲线，同时用普通PCR结合琼脂糖凝胶电泳利用Quantity One软件定量并制作标准曲线。结果 Taqman法检出GAPDH的下限为2．0×10^4拷贝，线性范围：2．0×10^4～2．0×10^10拷贝；SYBR GreenⅠ法检出GAPDH的下限为2．0×10^7拷贝，线性范围：2．0×10^7～2．0×10^10拷贝；普通PCR检出GAPDH的下限为2．0×10^6拷贝，线性范围：2．0×10^7～2．0×10^9拷贝。结论 Taqman荧光定量PCR法比SYBR GreenⅠ荧光定量PCR法和普通PCR法的灵敏度高，线性范围宽，是核酸水平对GAPDH定量的好方法。

siRNA对鸡胚成纤维细胞中GAPDH基因表达的抑制作用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是通过短双链RNA(small interference RNA,siRNA)介导的特异性抑制相应基因表达的新技术。作为研究基因功能的有效手段,该技术已在线虫、果蝇、斑马鱼和鼠等动物中进行了应用。本研究利用体外转录合成的短双链干扰RNA(siRNA),针对鸡的管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH),在鸡胚成纤维细胞中对其表达进行干扰。结果显示siGAPDH能有效阻断GAPDH基因在鸡胚成纤维细胞中的表达,而不相关的siRNA则对该基因的表达没有影响,证明在鸡细胞中也存在RNA干扰现象,为利用RNAi技术对鸡的基因功能研究奠定了一定基础。

刺五加GAPDH基因全长cDNA的克隆与生物信息学分析

采用cDNA末端RACE技术,从刺五加叶片中克隆到GAPDH基因cDNA的全长序列,并运用生物信息学方法对该基因的cDNA序列、保守区、氨基酸序列、亲缘关系等特征进行分析,并预测其编码蛋白质的结构和功能。研究结果表明,刺五加GAPGH基因的cDNA全长为1 437 bp,开放阅读框全长为1 023 bp,编码一个具有340个氨基酸残基的蛋白,蛋白分子质量为37.070 ku,理论等电点(pI)为7.71。刺五加GAPDH蛋白不存在跨膜结构域,定位于细胞质中,属于亲水蛋白。