鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB和伴侣蛋白Hfq对Ⅲ型分泌系统相关基因的调控

细菌的Ⅲ型分泌系统(T3SS)与毒力密切相关。为探究鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB和伴侣蛋白Hfq对T3SS相关基因spaP、invC、invG、prgH、prgI、prgJ、prgK的调控,利用Red同源重组技术构建了上述基因与lacZ的融合菌株,在此基础上利用P22噬菌体转导技术分别构建上述融合菌株与gcvB、hfq的单缺失菌株,通过qPCR和β-半乳糖苷酶试验分别检测gcvB、hfq缺失后各基因的转录水平和蛋白水平的变化。结果显示:与标准菌株相比,gcvB缺失后,spaP、invC、prgH、prgI、invG的转录水平和蛋白水平均上调;prgJ、prgK的转录水平上调,蛋白水平下调。hfq缺失后,spaP、invC、prgH、prgI、invG的转录水平和蛋白水平均上调,prgH、prgI、prgJ、prgK的蛋白水平下调。表明Hfq和GcvB均可对spaP、invC、invG、prgH、prgI、prgJ、prgK进行调控。上述结果可为鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB和Hfq的作用机理研究提供参考。

基于GCV的迭代Tikhonov正则化在测绘中的应用

由于Tikhonov正则化(Tikhonov regularization,TR)法求解大地测量领域中的病态问题时,其求解质量过于依赖正则化参数的确定,且稳定性较差,因此提出改进的迭代Tikhonov正则化(iterated Tikhonov regularization,ITR)法,结合广义交叉验证法(generalized cross-validation,GCV),可以有效克服上述缺点。算例结果表明,ITR-GCV法在解算精度、稳定性以及抗干扰性方面表现良好。

pLTKcSN/VPC及GCV系统的旁观者效应观察

目的：探讨单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因（ＴＫ）逆转录病毒载体生产细胞（ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ）和更昔洛韦（ＧＣＶ）系统杀伤恶性胶质瘤细胞过程中的旁观者效应。方法：采用大鼠胶质瘤细胞Ｃ６、人恶性胶质瘤Ｕ８７ＭＧ和它们的转染ＴＫ阳性细胞Ｃ６ＴＫ，Ｕ８７ＴＫ，将Ｃ６与Ｃ６ＴＫ，Ｕ８７ＭＧ和Ｕ８７ＴＫ按比例（ＴＫ阳性细胞占细胞总体的０％～１００％，１０％梯度）分别混合培养于９６孔板中，每种混合比例设６孔。培养２４ｈ后，６孔中３孔加入浓度为０．５μｇ／ｍｌＧＣＶ，另外３孔作为空白对照。继续培养７２ｈ，直接计数各孔活细胞数并以对照组计数结果为本底计算ＧＣＶ对各混合比例的抑制率。结果：当ＴＫ阳性细胞占１０％时，Ｃ６和Ｕ８７ＭＧ组的抑制率达到或超过３０％，当ＴＫ阳性细胞占总体的５０％以上时，ＧＣＶ对各混合比例的抑制率接近１００％。结论：ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ和ＧＣＶ系统杀伤恶性胶质瘤细胞过程中存在明显的旁观者效应。

大鼠肝癌细胞HSV-tk/GCV自杀基因系统的构建及其旁观者效应

目的:构建针对大鼠肝癌细胞的HSV-tk/GCV(以下简称tk/GCV系统)自杀基因治疗系统,建立比较tk/GCV系统作用效果及其旁观者效应大小的细胞模型和检测方法.方法:用包装细胞PT67/tk分泌的重组逆转录病毒的活性颗粒感染大鼠肝癌CBRH7919细胞,用G418筛选3wk获得高耐药性的重组子CBRH7919/tk,扩大培养.提取CBRH7919(tk-),CBRH7919/tk(tk+)细胞的DNA,把HSV-tk基因片段用Dig标记为探针后,与2种DNA及阳性对照DNA进行点杂交,以检测tk+细胞的DNA是否整合有HSV-tk基因.用0.1、1、10、50、100mg/L的GCV体外作用于tk-、tk+细胞,MTT检测存活率.用GCV体外分别作用于含不同比例tk+细胞的tk+、tk-混合细胞,MTT检测存活率,比较分析各组旁观者效应大小,确定后续实验的合适tk+比例.结果:用G418筛选3wk后获到高耐药性的CBRH7919/tk(tk+)重组细胞.HSV-tk基因片段用Dig标记为探针后进行点杂交,检测到tk+细胞DNA上已整合有HSV-tk基因,而tk-细胞DNA不含HSV-tk基因.GCV对tk+细胞生长抑制和细胞毒作用明显,而且有浓度、时间依赖性,而tk-细胞对GCV不敏感,说明HSV-tk基因已表达且表达产物具有生物学活性.GCV对含5%和10%tk+的混合细胞杀伤率分别为6.0%和25.2%,结果表明5-10%的tk+混合比例下自杀基因系统自身的旁观者效应较低,而且用MTT检测旁观者效应大小时灵敏度比较高,可作为后续研究中药活性成分对旁观者效应增效作用的tk+、tk-混合比例.结论:成功构建了针对大鼠肝癌的HSV1-tk/GCV自杀基因治疗系统,建立了体外快速筛选旁观者效应增效药物的稳定有效的细胞模型和检测方法.

HSV-tk/GCV系统对ACC-M细胞作用的体外试验

目的：为研究ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ系统对涎腺腺样囊性癌细胞株（ＡＣＣ－Ｍ）细胞的体外杀伤作用。方法：采用ＭＴＴ法和细胞计数法对ＧＣＶ在不同剂量和不同作用时间时细胞的生存率进行研究。结果：ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ系统能有效地杀伤ＡＣＣ－Ｍ细胞，杀伤呈时间依赖性和剂量依赖性，这种作用有比较明显的旁杀伤效应，旁杀伤效应的强弱与细胞间的接触程度呈正比关系。结论：ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ系统能有效地杀伤ＡＣＣ细胞，可望用于ＡＣＣ的治疗。

基于GCV准则的小波图像去噪方法研究

小波软阈值去噪的关键在于阈值的选择。常用的阈值计算方法主要针对噪声信号为不相关的情况,并需要对噪声方差进行估计。对于含有未知噪声的信号,提出一种GCV准则确定阈值的小波去噪方法,并证明该方法得到的阈值是一种渐近最优解。该方法与常用的基于固定阈值和SURE阈值的去噪法进行比较,结果表明,无论是肉眼观察还是利用均方差和信噪比进行客观评价,基于GCV准则的小波去噪方法可以在噪声未知的情况下,有效的去除信号噪声,并很好的保留信号的原始特征。

EB病毒LMP1通过NF-kB介导的HSV-tk/GCV治疗EBV相关肿瘤的研究

目的:研究EB病毒潜伏膜蛋白1(EBV-LMP1)通过活化NF-kB反式激活HIV-LTR进而启动自杀基困HSV-tk在EBV相关肿瘤治疗中的作用,为进一步开展肿瘤治疗提供科学的实验依据。方法:以鼻咽癌细胞为实验模型,将HSV-tk基因置于HIV-LTR调控序列之下,构建LMP1调控且依赖于NF-kB的HSV-tk/GCV系统,采用同位素方法检测tk活性来研究LMP1通过NF-kB调控HSV-tk转录的靶向性和表达特征,MTT方法检测在GCV处理下肿瘤细胞的生长状况。结果:成功构建受LMP1调控且依赖于NF-kB的HSV-tk表达质粒,发现其在GCV处理下,表达LMP1的肿瘤细胞的生长有显著的抑制。结论;携带有LMP1-HSV-tk的细胞对GCV治疗高度敏感,显示这一肿瘤治疗系统在EBV相关肿瘤中具有一定的应用前景。

HSV-tk/GCV系统杀伤ACC-M细胞的机理研究

目的 为探索HSV-tk/GCV(单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因/羟甲基无环鸟苷)基因治疗系统杀伤人高转移性腺样囊性癌细胞ACC-M 的机理。方法 采用荧光染色荧光显微镜观察、细胞DNA 电泳、流式细胞仪检测等方法。结果 研究发现,荧光染色有明显的细胞凋亡小体和染色质边聚现象;在GCV浓度较大(400 μm ol/L)作用时间较长(4 天)时有较明显的DNA 梯状现象;而FCM 发现在400 μm ol/LGCV 作用下有极明显的亚G1 峰。结论 HSV-tk/GCV基因治疗系统杀伤ACC-M

TK/GCV系统对骨肉瘤MG-63细胞杀伤的体外实验研究

目的:探讨脂质体介导的TK/GCV系统对骨肉瘤MG-63细胞的杀伤作用以及所产生的旁观者效应。方法:脂质体介导TK基因体外转染骨肉瘤MG-63细胞,倒置荧光显微镜观察细胞转染是否成功,流式细胞仪检测转染细胞与未转染细胞的转染效率。将未转染的骨肉瘤MG-63细胞分为3组,实验1组用转染TK/GCV的细胞上清液与原培养液按1/10、1/7、1/5、1/2比例混和液培养;实验2组用0.22μm滤器过滤的转染后的细胞上清液与原培养液按1/10、1/7、1/5、1/2比例混和液培养;对照组用培养液培养,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法分别测定各组细胞的生长抑制率及骨肉瘤细胞对TK/GCV系统的敏感性。结果:经TK基因转染的MG-63细胞,倒置荧光显微镜下有大量绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪检测转染TK基因的细胞转染效率可达75.5%。6 d后MTT检测结果显示实验1组中各比例浓度的混合培养液对细胞的抑制率与对照组相比有统计学意义(P<0.05);实验2组中1/10、1/7比例浓度的混合培养液对细胞的抑制率与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。经TK基因转染的MG-63细胞随GCV浓度增加,细胞凋亡率增加。结论:脂质体介导的TK/GCV系统能够通过旁观者效应抑制骨肉瘤MG-63细胞的生长。

应用RV-HSV-TK基因转染胰腺癌细胞及转染阳性的细胞对GCV敏感性研究

由缺陷型逆转录病毒介导的TK基因系统（RV－HSV－TK）是众多肿瘤生物治疗方法中一个技术较为成熟的方案，本实验采用该系统在体外成功地转染了人胰腺癌细胞株SW1990并能够稳定传代培养，转染了TK基因的SW1990细胞（SW±K），其生长曲线与未转染的SW1990细胞无差异。10－4～102μg／ml的GCV对SWtk有明显的毒性作用（IC50＝2．5μg／ml），杀伤效应与时间成正比，作用48小时以后开始出现毒性作用。将SW1990细胞与包装细胞共孵育48小时以上，再加入10μg／ml的GCV作用120小时，约有50％的SW1990细胞被杀死。结果表明：采用RV－HSV－TK系统转染胰腺癌细胞，有较高的转染效率，转染了TK基因的胰腺癌细胞对GCV敏感。

细胞缝隙连接与HSV-TK/GCV系统旁观者效应的关系

在用单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)自杀基因系统治疗肿瘤的研究中,一个有趣和重要的现象就是旁观者效应(bystander effect,BE)。它在很大程度上提高了HSV-TK/GCV系统治疗肿瘤的疗效。但到目前为止,BE的确切机制尚未阐明。大量研究表明,靶细胞连接蛋白(connexin,Cx)的表达及其形成的细胞间缝隙连接(gapjunction,GJ)与这一现象关系密切。该文对GJ与HSV-TK/GCV系统BE的关系作一综述,并探讨了由HSV-TK/GCV系统生成可经GJ传递的"死亡信号"的性质。

乳腺癌特异性多肽介导的HSV-TK/GCV系统的构建及其靶向杀伤效应

目的:研究乳腺癌MDA-MB-231细胞特异性转导多肽PI介导的HSV-TK/GCV抗瘤系统对乳腺癌MDA-MB-231细胞的体外靶向杀伤作用。方法:以PCR从质粒pORF-HSV-TK中扩增目的基因PI-TK,克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建pET-28a(+)-PI-TK载体,转化宿主菌,经IPTG诱导表达PI-TK融合蛋白,利用His-Tag对其进行纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定PI-TK融合蛋白。将不同质量浓度的PI-TK融合蛋白与MDA-MB-231细胞共培养,联合更昔洛韦(ganci-clovier,GCV)作用后,倒置显微镜下观察细胞的形态变化,CCK-8法检测MDA-MB-231细胞的增殖。结果:成功构建了重组原核表达载体pET-28a(+)-PI-TK,获得纯化的PI-TK融合蛋白,SDS-PAGE及Western blotting鉴定PI-TK融合蛋白表达正确。单独PI-TK融合蛋白不影响MDA-MB-231细胞的形态和增殖,但PI-TK融合蛋白联合GCV能剂量依赖性靶向抑制MDA-MB-231细胞的增殖,200μg/ml PI-TK+10 mg/LGCV作用的抑制率达(68.9±7.57)%;PI-TK联合GCV抑制MDA-MB-231细胞的IC50值为152.64μg/ml。上述各作用对MDA-MB-435细胞均无影响(P<0.05)。结论:乳腺癌特异性转导多肽PI介导的HSV-TK/GCV抗瘤系统可靶向杀伤MDA-MB-231细胞。

HSV-tk/GCV自杀基因系统对视网膜母细胞瘤的体外抗肿瘤效应

目的 研究单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶 /更昔洛韦 (herpessimplexvirusthymidinekinase /gancyclovir,HSV tk/GCV)自杀基因系统对视网膜母细胞瘤 (retinoblastoma ,Rb)细胞的体外杀伤作用以及旁观者效应发生的机制。方法 应用脂质体将pCMV/hytk IRES hrGFP质粒导入HXO Rb44细胞株。用潮霉素筛选出阳性细胞克隆并命名为HXO Rb44/tk。RT PCR鉴定hytk基因在HXO Rb44/tk细胞中的转录结果。比较HXO Rb44和HXO Rb44/tk细胞的形态特征及生长特性。通过MTT法检测GCV对不同比例HXO Rb44/tk和HXO Rb44混合细胞的杀伤作用 (“旁观者效应”)。并通过上清移换实验研究旁观者效应发生的机制。结果 HXO Rb44/tk细胞经RT PCR可检测出 5 30bp的hytk基因片段。HXO Rb44/tk和HXO Rb44细胞的形态特征及生长特性无明显差异。HXO Rb44/tk细胞仅占很低比例时即可观察到明显的旁观者效应 ,而GCV作用的HXO Rb44/tk细胞上清对HXO Rb44细胞无杀伤作用。结论 HSV tk基因转移联合GCV治疗可作为Rb基因治疗的一种有效方法 。

HSV-tk/GCV协同放射治疗黑色素瘤的实验研究

目的：了解ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ系统协同放射治疗对小鼠黑色素瘤的联合杀伤作用。方法：通过逆转录病毒介导，将潮霉素磷酸转移酶和ＨＳＶ－ｔｋ的融合基因（ｈｙｔｋ）导入黑色素瘤细胞中并获得表达，通过体外和Ｃ５７ＢＬ／６小鼠动物实验，检测 ＧＣＶ对转基因细胞的体内外杀伤作用及联合应用放射治疗对黑色素瘤的治疗作用。结果：ＰＣＲ、ＲＮＡ Ｄｏｔ ｂｌｏｔｔｉｎｇ、免疫组化检测证实ＨｙＴＫ在转基因细胞的表达，体内外实验示ＧＣＶ对Ｂ１６／ＨｙＴＫ细胞有明显的杀伤作用，而对野生型Ｂ１６细胞无明显杀伤作用（Ｐ＜０．０５）；联合应用低剂量ＧＣＶ可使转入ｈｙｔｋ基因的黑色素瘤细胞对放疗的敏感性明显增高（ＳＥＲ＝１．６２），体内实验也证实协同疗法可延缓荷瘤小鼠的肿瘤生长。结论：ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ系统协同放射治疗有望成为黑色素瘤基因治疗的一种有效方法。

基于GCV准则与Otsu法的Canny算子研究

为了增强图像的可读性,解决因光照、噪声等因素造成的图像模糊、边缘不清等问题,在前人研究的基础上提出了对Canny算子的改进。用遗传算法对基于GCV准则的阈值函数自动寻优,在降低噪声的同时增强了图像的可读性;用评价函数对Otsu法自适应设定高低阈值,无需考虑阈值比例,减少了伪边缘现象。不同图像的边缘提取实验和数据分析表明,该方法在检测精度、抗噪能力和运算效率等方面都得到明显提高。对于存在的不足提出了进一步研究方向。

HSV-TK/GCV系统对人肺癌细胞株的杀伤效应

目的 观察单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV -TK/GCV系统对人肺癌细胞H4 4 6的体外杀伤作用。方法 利用脂质体(lipofectin)将重组逆转录病毒载体pLXSN -TK导入包装细胞PA317,G4 18筛选至抗性克隆出现 ,收获病毒液。加入聚凝胺感染H4 4 6细胞 ,并筛选出含TK基因的H4 4 6细胞。观察GCV对H4 4 6和不同比例混合的H4 4 6、H4 4 6 /TK的杀伤作用及旁观者效应。结果 经电镜及PCR检测证实TK基因已导入PA317、H4 4 6细胞。H4 4 6 /TK细胞对GCV的敏感性明显高于H4 4 6细胞 ;随着TK+ 细胞比例的增加 ,存活率进一步减低 ,提示GCV不仅杀死TK+ 细胞 ,也杀死混合培养的未转导TK基因的H4 4 6细胞 ,表明HSV -TK基因转导的H4 4 6细胞具有明显的旁观者效应。结论 HSV -TK/GCV系统赋予人肺癌细胞对GCV的高敏感性及旁观者效应。

基于L曲线法和GCV法的有理多项式参数求解

在求解有理函数模型的多项式参数时,通常采用的是最小二乘估计方法进行求解,但若控制点分布不均匀或模型过度参数化,则法方程矩阵很容易产生病态,不能得到正确的解。使用Tikhonov正则化方法可以较好地改善法方程的状态,使方程解趋于稳定。通过影像数据,分别采用了L曲线法和GCV法进行试验,试验证明该方法使RPC参数的解算精度有了显著提高,验证了该种方法在求解病态矩阵误差方程中的正确性。

重组IFN-α2a与HSV-tk/GCV系统协同作用增强对于卵巢癌细胞系SKOV3杀伤作用的体外研究

目的 :观察应用重组IFN α2a能否增强单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因 (HSV tk) /丙氧鸟苷 (GCV)系统对卵巢癌细胞系SKOV3的杀伤效应。方法 :利用逆转录病毒载体将潮霉素磷酸转移酶和HSV tk的融合基因 (hytk)导入SKOV3细胞 ,测定GCV对SKOV3/hytk细胞的杀伤作用和旁观者效应。观察IFN α2a与HSV tk/GCV协同作用对旁观者效应的影响 ,并且在联合应用GCV和IFN α2a后 ,进行细胞周期分析。结果 :GCV对SKOV3/hytk细胞有明显的杀伤作用 ,并且可以同时杀伤周围未转基因的细胞 ,联合应用IFN α2a与HSV tk/GCV可以明显增强旁观者效应 (P <0 .0 5 ) ,使处于S期的SKOV3/hytk细胞较对照组和使用单药组明显增多 (P <0 .0 1)。结论 :IFN α2a与HSV tk/GCV联合应用可以产生协同作用 ,增强HSV tk/GCV系统在体外对卵巢癌细胞系SKOV3的杀伤效应 。

Psi2STK/GCV与鼠C6神经胶质瘤细胞的相互作用

目的 :研究利用基因工程包装细胞进行基因转导与药物相结合来治疗脑胶质瘤的可行性。方法 :利用基因转导技术及分子生物学方法构建了逆转录病毒载体 STK及基因工程包装细胞psi2 STK,并利用 psi2 STK细胞和丙氧鸟苷 ( GCV)结合对胶质瘤细胞进行了离体的基因治疗研究。结果 :实验组 C6Bp BAG+ psi2 STK由于有 psi2 STK细胞的存在 ,对 GCV的敏感性比对照组C6Bp BAG+ psi2 STK明显增强。结论 :通过体外实验证实了逆转录病毒转导 HSV- TK基因 ,在培养 C6胶质瘤细胞中 ,提高了其对