滋阴补阳方对PCOS大鼠GDF-9、BMPRⅡ基因表达的影响

探讨滋阴补阳方对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠卵泡生长因子的影响。方法 建立PCOS大鼠模型,分为模型对照组(B)、补阳方低剂量(BL)、补阳方中剂量(BM)、补阳方高剂量(BH)组、滋阴方低剂量(ZL)、滋阴方中剂量(ZM)、滋阴高方剂量(ZH)组、克罗米芬组(C)及空白对照组(A)共9组,检测卵巢组织内GDF-9和BMPRⅡ基因的表达。结果 卵巢组织中均有GDF-9、BMPRⅡ的表达,其中B组与A组之间GDF-9 、BMPRⅡ的表达量有明显的差异,在对PCOS模型大鼠给药后,ZH组和BH组效果最为明显。结论 GDF-9 、BMPRⅡ在促进卵泡生长发育过程中具有重要作用,滋阴补阳方对PCOS模型大鼠有明显的剂量依赖关系。

卵母细胞来源的生长因子GDF-9和GDF-9B/BMP-15

生长分化因子9(GDF-9)和生长分化因子9B(GDF-9B)即骨形态发生蛋白-15(BMP-15),来源于卵巢卵母细胞,是TGF-β基因超家族的新成员,二者较其他成员具有更多的同源性,因而形成一个明显的亚群。它们在卵巢的表达模式极其相似,共同表达于卵母细胞,对卵泡的生长发育起重要的调节作用。

GDF-9和BMP-15在不同品系小鼠中的多态性和生殖能力关联分析

目的研究GDF-9和BMP-15在繁殖能力不同的品系小鼠ICR和BALB/c中的多态性,为筛选相关的模型动物种群提供参考资料。方法采用直接测序法筛查多态性位点,并对多态性位点构建双荧光素酶报告基因载体,检测5’UTR对下游基因的影响。结果 ICR小鼠的产仔数是BALB/c的2.8倍左右;在ICR和BALB/c之间发现了GDF-9存在三个多态性位点,一个位于5’端的非编码区,另外两个位于蛋白编码区;双荧光素酶检测结果显示GDF-9的5’UTR区可以促进下游基因的表达。BMP15在两种品系中不存在差异性位点。结论 GDF-9在ICR和BALB/c这两个品系小鼠中存在多态性位点,这些位点的变化对下游基因的表达起一定的促进作用。BMP15在ICR和BALB/c小鼠中不存在多态性位点。

GDF-9基因真核表达载体的构建及其对牛卵丘细胞扩展相关基因表达的影响

为构建牛生长分化因子9(GDF-9)基因真核表达载体,观察GDF-9基因真核表达载体转染牛卵丘细胞后对卵丘扩展相关基因表达的影响,试验在质粒pcDNA4myc-his的多克隆位点插入GDF-9基因构建真核表达载体pcDNA4myc-his-GDF-9,用脂质体转染牛卵丘细胞,利用Western blotting检测了GDF-9蛋白的表达量,同时利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测牛卵丘细胞中卵丘扩展相关基因的表达量。结果发现,转染了pcDNA4myc-his-GDF-9的牛卵丘细胞中检测到GDF-9蛋白的表达,且牛卵丘细胞扩展相关基因PTGS2、PTX3和HAS2的表达量显著提高(P<0.05),表明牛pcDNA4myc-his-GDF-9可有效地转染到牛卵丘细胞中,该试验结果为进一步研究GDF-9基因的功能奠定了基础。

牛GDF-9基因的克隆与组织表达的分析

为了检测牛GDF-9基因mRNA在怀孕期牛生殖系统的表达情况,为GDF-9基因在雌性动物繁殖上的研究提供一定的理论依据。本试验根据GenBank中报道的牛GDF-9基因序列设计引物,从牛卵巢、输卵管、子宫、肾脏中提取RNA,采用RT-PCR技术进行cDNA扩增,扩增产物与载体pGM-T连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,测序。结果表明,已成功克隆的阳性重组子经测序鉴定其片段大小与预期大小完全一致,为264 bp。序列同源性分析比较表明,该cDNA及其推导的氨基酸序列与绵羊GDF-9cDNA和氨基酸序列同源性分别为97%和94%。以-βactin为内参照物,采用RT-PCR技术进行半定量分析,通过检测比较牛GDF-9基因在卵巢、输卵管、子宫、肾脏组织中mRNA的表达情况。结果表明,牛GDF-9基因在卵巢中表达量最高,在输卵管、子宫、肾脏中均有表达,但表达量不高。

左归丸对免疫性卵巢早衰小鼠卵巢GDF-9、BMP-15表达的影响

目的明确促卵泡发育的卵巢卵母细胞自分泌因子生长分化因子-9(GDF-9)、骨形态发生蛋白-15(BMP-15)的表达不足在免疫性卵巢早衰发病中的重要作用,进一步阐明补肾活血中药复方左归丸通过调节卵母细胞自分泌因子的表达,对卵巢起到保护作用。方法建立小鼠免疫性卵巢早衰模型:以小鼠透明带3所合成透明带多肽为免疫原。以出现动情周期紊乱、卵巢细胞受损,表示造模成功。然后将造模成功的小鼠随机分为模型组、左归丸高、低剂量组,强的松组、己烯雌酚组和对照组,共灌胃给药4周。免疫组化法检测GDF-9、BMP-15蛋白的表达。结果模型组与空白对照组相比,GDF-9蛋白表达水平下降,差异显著(P<0.05),左归丸低、高剂量组及己烯雌酚组与模型组相比,GDF-9蛋白表达水平增加,差异显著(P<0.05),与空白对照组相比,无显著差异。左归丸高剂量组GDF-9蛋白表达水平也较强的松组增加,差异显著(P<0.05)。模型组BMP-15蛋白表达水平较其余各组减少,但各组相比均无显著性差异(P>0.05)。结论左归丸对卵巢具有保护作用,能促进卵巢GDF-9蛋白的表达,从而促进卵泡的发育。

小鼠腔前卵泡体外培养中BMP-6和GDF-9的表达

目的观察BMP-6及GDF-9蛋白在小鼠体外培养卵泡中的定位和定量表达,探讨二者与卵泡发育的关系。方法采用免疫荧光和western blot技术观察BMP-6及GDF-9在体外培养的第6、10天卵泡的定位和定量表达情况。结果在体外培养中,腔前卵泡和有腔卵泡的卵母细胞和颗粒细胞中均检测到BMP-6和GDF-9蛋白的表达;western blot定量显示,在卵泡体外发育的不同阶段,BMP-6和GDF-9蛋白的表达水平不同。结论 BMP-6及GDF-9蛋白存在于体外培养卵泡的卵母细胞和颗粒细胞中;二者的表达水平随卵泡的发育成熟而发生变化。

补肾调经膏方对肾虚型卵巢早衰患者性激素、GDF-9及BMP-15水平的影响

目的观察补肾调经膏方对肾虚型卵巢早衰患者性激素、生长分化因子-9(GDF-9)及骨形态发生蛋白-15(BMP-15)水平的影响。方法将110例肾虚型卵巢早衰患者随机分为2组,对照组55例给予激素替代疗法治疗,观察组55例在此基础上加用补肾调经膏方治疗,观察2组治疗前后主要证候积分、Kupperman评分及血清雌二醇(E2)、促卵泡生长激素(FSH)、黄体生成素(LH)、GDF-9及BMP-15水平变化情况,统计2组近期疗效,随访2组6个月复发情况。结果治疗后2组主要证候积分、Kupperman评分及血清FSH、LH水平均显著降低(P均<0.05),E2、GDF-9及BMP-15水平均显著提高(P均<0.05),且观察组治疗后以上指标改善情况均显著优于对照组(P均<0.05);观察组治疗总有效率显著高于对照组(P<0.05),随访6个月复发率显著低于对照组(P<0.05)。结论补肾调经膏方治疗肾虚型卵巢早衰可有效减轻相关症状体征,改善生殖轴状态,上调GDF-9和BMP-15水平,且有助于降低远期复发风险。

人卵丘颗粒细胞ADAMTS-1、GDF-9表达水平与IVF胚胎学结局的相关性分析

目的研究人卵丘颗粒细胞ADAMTS-1、GDF-9表达水平与体外受精—胚胎移植(IVF)胚胎学结局的相关性。方法采用前瞻性研究方法,将于我校附属医院诊断并进行IVF治疗的120例不孕症患者作为观察组,根据妊娠结局将其分为妊娠成功组(75例)和妊娠失败组(45例);另选取120例同期进行健康体检的女性作为对照组。比较观察组和对照组以及不同IVF胚胎学结局患者ADAMTS-1、GDF-9表达水平,采用Spearman相关性分析IVF胚胎学结局与ADAMTS-1、GDF-9表达水平的相关性,绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析各指标检测价值。结果观察组的ADAMTS-1(t=6.936,P=0.000)、GDF-9(t=19.487,P=0.000)表达水平显著低于对照组;妊娠成功组的ADAMTS-1(t=18.912,P=0.000)、GDF-9(t=18.224,P=0.000)表达水平显著高于妊娠失败组。Spearman相关性分析结果显示,患者的IVF胚胎学结局与ADAMTS-1、GDF-9表达水平呈正相关。ADAMTS-1、GDF-9表达水平的联合检测特异度显著高于单独检测,ADAMTS-1、GDF-9表达水平联合检测的曲线下面积(AUC)显著高于单独检测(P<0.05);针对妊娠失败的患者,ADAMTS-1、GDF-9的临界值分别为0.3及0.15。结论人卵丘颗粒细胞ADAMTS-1、GDF-9表达水平与IVF胚胎学结局呈现显著的相关性,可作为临床诊断的重要依据。

脱氢表雄酮对卵巢储备功能减退患者IVF结 局及卵泡液GDF-9 、BMP-15的影响

目的探讨脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)对卵巢储备功能减退(diminished ovarian reserve,DOR)患者的卵巢功能、卵泡液中生长分化因子-9(growth differentiation factor-9,GDF-9)、骨形态发生蛋白-15(bone morphogenetic protein-15,BMP-15)浓度及体外受精/卵胞质内单精子显微注射-胚胎移植(in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer,IVF/ICSI-ET)结局的影响。方法采用历史性队列研究,共纳入163例行IVF/ICSI-ET助孕的DOR患者,根据预处理方案分为DHEA组和对照组。比较两组患者基础内分泌水平、抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)、窦卵泡数(antral follicle counts,AFC)、促性腺激素(gonadotropin,Gn)总量、Gn使用天数、人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)日激素浓度和子宫内膜厚度、获卵数、成熟卵数、受精率、优胚率、胚胎种植率及临床妊娠率。比较两组患者卵泡液GDF-9、BMP-15浓度,并将其与卵巢储备功能指标进行相关性分析。结果DHEA预处理前两组基础内分泌、AMH、AFC差异均无统计学意义(P>0.05),预处理后,DHEA组基础卵泡刺激素(basal follicle stimulating hormone,bFSH)降低、AFC增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。Gn总量、Gn天数、hCG日激素浓度、hCG日子宫内膜厚度、获卵数、成熟卵数、受精率、优胚率、胚胎种植率、临床妊娠率差异均无统计学意义(P>0.05)。DHEA组卵泡液中BMP-15浓度高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),GDF-9差异无统计学意义(P>0.05)。双侧Pearson相关系数分析显示卵泡液BMP-15表达与基础雌二醇(estradiol,E 2)呈正相关。结论DHEA可通过增加AFC和下调FSH改善DOR患者的卵巢储备功能并提高卵泡液BMP-15的浓度。

模拟肾虚痰湿特征信息PCOS大鼠模型中GDF-9、BMPR-2的表达研究

目的:探讨生长分化因子-9(GDF-9)及骨形态发生蛋白受体-2(BMPR-2)在有肾虚痰湿特征信息的肥胖多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠模型的卵巢颗粒细胞中的表达。方法:分别在来曲唑(Letrozole)和脱氢表雄酮(DHEA)造模基础上加用高脂乳剂,建立肥胖PCOS动物模型,结合阴道脱落细胞涂片、大鼠体质量增加幅度、血脂水平和卵巢形态学的改变进行模型验证,选用免疫组化法检测大鼠模型卵巢组织卵泡颗粒细胞中GDF-9、BMPR-2的表达。结果:模型建立成功,Letrozole模型组、Letrozole肥胖模型组GDP-9积分光密度总和均显著低于高脂模型组。此外,Letrozole肥胖模型组GDP-9平均灰度均值低于高脂模型组,DHEA模型组和DHEA肥胖模型组GDF-9积分光密度总和均显著高于空白对照组,Letrozole模型组BMPR-2积分光密度总和均显著高于高脂模型组,DHEA模型组BMPR-2积分光密度总和显著高于高脂模型组。结论:推测GDF-9、BMPR-2在肥胖PCOS大鼠模型卵巢的卵泡颗粒细胞中表达降低可能是肥胖PCOS发生发展的重要原因。

r-hGH联合DHEA对卵巢低反应小鼠GDF-9、AGE、RAGE表达的影响

目的 探究重组人生长激素(r-hGH)联合脱氢表雄酮(DHEA)对卵巢低反应(POR)小鼠模型干预效果及对生长分化因子-9(GDF-9)、晚期糖基化终末产物(AGE)及其受体(RAGE)的影响。方法 100只小鼠随机分为对照组、模型组、r-hGH组、DHEA组和r-hGH+DHEA组。使用慢性制动应激法建立卵巢早衰及卵巢低反应小鼠模型,对照组用等量的溶剂处理。r-hGH组和DHEA组分别使用r-hGH和DHEA干预,r-hGH+DHEA组进行联合干预。检测血清抗苗勒管激素(AMH)水平。使用HE染色法检测卵巢中卵泡数量。qRT-PCR和Western blotting检测卵巢组织中AGE、RAGE和卵泡中GDF-9 mRNA和蛋白水平。结果 建模后,小鼠血清AMH、卵泡数目以及GDF-9 mRNA和蛋白水平降低,而AGE、RAGE mRNA和蛋白水平升高(P<0.05)。r-hGH组和DHEA组的AMH、卵泡数目以及GDF-9 mRNA和蛋白水平高于模型组,而AGE、RAGE mRNA和蛋白水平低于模型组(P<0.05)。r-hGH+DHEA组AMH、卵泡数目以及GDF-9 mRNA和蛋白水平高于r-hGH组和DHEA组,而AGE、RAGE mRNA和蛋白水平低于r-hGH组和DHEA组(P<0.05)。结论 r-hGH联合DHEA对POR小鼠具有较好干预效果,与下调卵巢中AGE、RAGE并促进GDF-9 mRNA和蛋白的表达有关。

自然排卵、促排卵和超促排卵状态下小鼠卵巢组织中生长分化因子-9(GDF-9)的表达

目的:观察自然周期排卵、促排卵与控制性超促排卵(COH)状态下小鼠卵巢生长分化因子-9(growth differentiation factor,GDF-9)表达水平的变化情况。方法:成年雌性小鼠随机分为3组每组10只,分别为自然排卵组(对照组)、孕马血清(PMSG)促排卵组(PMSG组)、控制性超促排卵组(COH组),各组小鼠取排卵期卵巢组织,采用免疫组织化学方法检测GDF-9的表达与定位,并分别采用Western blottting和实时荧光定量PCR法,定量检测GDF-9蛋白与mRNA的含量。结果:各组小鼠卵母细胞与颗粒细胞中均检测到GDF-9的表达,PMSG组与COH组GDF-9蛋白与mRNA的表达水平均显著高于对照组(P<0.05),PMSG组的表达也明显弱于COH组(P<0.05)。结论:促排卵可促进小鼠卵巢GDF-9的表达,但COH降低促排卵小鼠卵巢GDF-9的表达。

中药疏肝化瘀方对子宫内膜异位症患者卵巢颗粒细胞GDF-9的影响

目的:探讨疏肝化瘀中药对子宫内膜异位症(EMs)患者卵泡液颗粒细胞生长分化因子-9(GDF-9)的影响。方法:将40例因EMs行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的患者随机分为中药+控制性超促排卵组(A组,n=20)和单纯性控制性超促排卵组(B组,n=20);另选择同期因输卵管因素行IVF-ET的患者为正常对照组(C组,n=20)。应用Western blotting法检测卵巢颗粒细胞中GDF-9的表达;并比较3组间的妊娠结局。结果:B组比C组促卵泡激素(FSH)用量明显增加,而获卵数、受精率、优质胚胎率及妊娠率明显降低;A组和B组颗粒细胞中GDF-9的表达低于C组(P<0.01);A组较B组FSH用量减少(P<0.000 1),获卵数、受精率、优质胚胎率及妊娠率明显增加(P<0.01);A组颗粒细胞中GDF-9的相对表达量(0.56±0.12)显著高于B组(0.21±0.09)(P<0.05)。结论:EMs患者颗粒细胞中GDF-9的表达水平低于正常孕龄妇女,疏肝化瘀中药可以提高EMs患者GDF-9的表达水平,改善胚胎质量,提高妊娠率。

卵泡发生过程中GDF-9和BMP-15(GDF-9B)的作用

近年来,对卵巢内卵泡发育,即从原始卵泡募集、优势选择、卵泡生长、排卵到黄体形成的调控研究取得了很大的进展。研究表明TGF-β超家族的许多成员在各阶段卵泡发生中起重要的调节作用。TGF-β超家族的两个成员--生长分化因子-9(GDF-9)和骨形态因子-15(BMP-15,或GDF-9B)主要在哺乳动物卵母细胞中表达,对卵泡生长发育起关键作用。本文对GDF-9和BMP-15在卵泡发育过程中的作用进行了综述。

GDF-9和BMP-15在子宫肌瘤中的表达

目的:了解GDF-9和BMP-15在子宫肌瘤及邻近正常平滑肌中的表达,为进一步探讨子宫肌瘤发病机制提供实验依据。方法:免疫组织化学方法检测手术切除的子宫肌瘤和邻近平滑肌组织中蛋白的表达;消化法和组织块贴壁法进行子宫肌瘤细胞和邻近平滑肌细胞原代培养,Real-time PCR(RT-PCR)检测所培养子宫肌瘤和邻近平滑肌细胞中GDF-9和BMP-15的表达。结果:GDF-9和BMP-15蛋白在子宫肌瘤和邻近平滑肌组织中的表达无统计学差异;消化法和组织块贴壁法2种细胞培养法均建立了有限细胞系,Real-time PCR检测结果显示GDF-9和BMP-15mRNA在子宫肌瘤细胞中的表达均高于邻近平滑肌细胞。结论:GDF-9和BMP-15在mRNA水平对基因信号调控方面有影响,可能促进子宫肌瘤的增殖、肥大,与子宫肌瘤的发生发展有一定的相关性。

不同促排卵方案在IVF卵巢低反应患者中的应用及对血清和卵泡液中GDF-9、BMP-15水平的影响

目的探讨GnRH-a短方案、GnRH-ant方案及来曲唑微刺激三种不同促排卵方案在IVF卵巢低反应患者促排卵中的应用效果及其对血清和卵泡液中GDF-9、BMP-15水平的影响。方法选择在我院生殖医学中心接受IVF/ICSI且卵巢低反应的不孕症患者共89例,随机地分为三组:A组(GnRH-a短方案组)33例,B组(GnRH-ant方案组)31例,C组(来曲唑微刺激方案组)25例。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测所有患者HCG日血清及取卵日卵泡液内GDF-9、BMP-15水平,用化学发光法测定所有患者基础内分泌值和HCG日内分泌值,分析不同促排卵方案患者的Gn用量,Gn用药天数,获卵数,受精率,卵裂率,优质胚胎率,着床率,周期取消率,移植周期临床妊娠率,流产率等相关指标。结果 (1)Gn用药天数、获卵数、受精率、卵裂率、优质胚胎率、周期取消率、移植周期临床妊娠率、流产率、着床率在A、B、C三组之间无统计学差异(P>0.05);Gn总量在A、B两组明显高于C组(P<0.05);(2)A、B、C三组血清和卵泡液中的GDF-9水平无统计学差异(P>0.05);C组血清和卵泡液中的BMP-15水平均显著高于A、B两组(P<0.05);A、B、C三组血清的GDF-9和BMP-15水平均显著低于卵泡液中的水平(P<0.05)。结论 IVF卵巢低反应患者应用GnRH-ant方案可以获得与GnRH-a短方案相似的临床效果;来曲唑联合小剂量Gn微刺激方案Gn用量较少,获得了与GnRH-a短方案及GnRH-ant方案相似的临床妊娠率,可能与来曲唑增加血清和卵泡液中BMP-15水平,提高了卵巢的反应性有关。

卵泡生长分化因子-9(GDF-9)在高胰岛素血症大鼠卵巢中的表达与意义

目的:探讨卵泡生长分化因子-9(GDF-9)在卵泡发育异常及激素水平变化等方面的作用机制。方法:①利用改良Poretsky方法建立高胰岛素血症动物模型(模型组,n=20):hCG×9d+胰岛素×22d。采用下列方法验证模型:测定空腹血糖、空腹胰岛素(FINS)、睾酮(T)、E2、LH、FSH,并计算胰岛素抵抗指数(HOMA1-IR);测定大鼠体重及卵巢重量;HE染色方法观察卵巢病理变化。②采用免疫组化和RT-PCR法检测模型动物及正常对照组(n=20)卵巢组织GDF-9 mRNA及蛋白的表达。结果:①与对照组比较,模型组FPG、FINS、HOMA1-IR、T升高(P<0.05)。②组间体重无统计学差异,但模型组卵巢重量显著大于对照组(P<0.05)。模型组各发育阶段卵泡明显减少,但囊性扩张的卵泡和闭锁卵泡增多,卵泡膜细胞增生,卵泡间质明显增厚。③模型组卵巢组织GDF-9 mRNA和蛋白的表达均显著低于对照组(P<0.05)。结论:高胰岛素血症减弱卵巢组织GDF-9 mRNA和蛋白的表达强度;表达降低的GDF-9可能与PCOS卵泡发育异常及激素水平变化有关。

补肾调经方、逍遥丸对小鼠卵母细胞GDF-9表达的比较研究

目的:观察补肾法、疏肝法对小鼠卵母细胞生长分化因子-9(growth differerntiation factor-9,GDF-9)蛋白及mRMA表达的影响。方法:将300只小鼠随机分为6组:补肾高、低剂量组;疏肝高、低剂量组;控制性超促排卵(COH)组和空白对照组,每组50只,应用Western blotting和Real-time PCR方法分别测定卵母细胞中GDF-9蛋白和mRNA的表达,并对比各组小鼠卵母细胞数量及优质卵泡率。结果:各治疗组卵母细胞中GDF-9蛋白及mRNA表达显著高于空白对照组及COH组,其中高剂量组优于低剂量组(P<0.05),COH组的GDF-9蛋白及mRNA表达较空白对照组降低(P<0.05);各治疗组及COH组卵母细胞数量高于空白对照组(P<0.05),治疗组中高剂量组卵母细胞数量高于低剂量组(P<0.05);各治疗组及空白对照组优质卵泡率优于COH组(P<0.05),治疗组中高剂量组的优质卵泡率优于空白对照组(P<0.05)。结论:补肾调经方、逍遥丸在促性腺激素应用的基础上能增加卵母细胞数量及优质卵泡率,其机制可能与调控卵母细胞中GDF-9的蛋白及mRNA表达有关。

人生长分化因子-9(GDF-9)基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建人生长分化因子-9(GDF-9)基因真核表达载体并分离纯化获得重组GDF-9蛋白。方法:以cDNA克隆为模板,PCR法扩增出人GDF-9基因,将目的基因连接到pcDNA3.1(+)真核表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1(+)/GDF-9,脂质体法将重组质粒转染到HEK293T细胞,通过Western blotting检测GDF-9蛋白表达。结果:以双酶切及基因测序鉴定构建的重组真核质粒,Western blotting方法证实人GDF-9基因正确表达。结论:成功构建人GDF-9基因pcDNA3.1(+)/GDF-9重组质粒,并在真核细胞系表达,获得重组GDF-9蛋白,为进一步研究GDF-9基因提供便利工具。