CRMP-1真核表达载体的构建及其突起生长抑制作用

为研究坍塌反应调节蛋白-1(collapsin response mediator protein-1,CRMP-1)对神经元突起生长的作用,构建了CRMP-1真核表达载体,以神经生长因子(NGF)诱导的PC12细胞为模型,采用基因转染、突起生长时差成像、突起提取和免疫印迹技术进行观察.结果显示,NGF诱导的PC12细胞具有典型的神经元形态特征,脂质体转染技术可成功地把CRMP-1基因导入细胞.过表达CRMP-1可明显抑制突起生长,促进突起坍塌,首先是细小突起缩短,然后是长突起,细胞突起的长度随CRMP-1蛋白表达时间延长呈逐渐缩短的趋势.突起提取液的测定显示,CRMP-1过表达的细胞较NGF诱导的和转染空载体的细胞突起明显减少(P<0.01).说明CRMP-1具有明显的突起生长抑制作用.

血管内皮生长因子基因的表达及血管生成作用

构建新的血管内皮生长因子（VEGF）高效真核表达载体pcD 2 /VEGF， 体外转染VSMC 发现其在VSMC中的表达效率较 pcDNA 3 /VEGF 明显增高，体外和体内实验证实VEGF 基因具有显著促进血管生成的作用。

Survivin和p63基因蛋白在食管鳞状细胞癌的表达及临床意义

目的探讨食管鳞状细胞癌(esophagealsquamouscarcinoma,ESC)组织中survivin和p63基因蛋白表达与ESC生物学行为的关系。方法应用免疫组织化学方法,检测65例ESC组织中survivin和p63蛋白表达水平。结果在ESC中survivin和p63表达阳性率分别为61.5%(40/65)和86.2%(56/65)。survivin和p63表达均与肿瘤分级、浸润、淋巴结转移和预后相关。结论survivin和p63异常表达与ESC的病理生物学行为密切相关,是预测ESC转移潜能和评估ESC患者预后的客观指标。

母源基因Gdf9、Zar1、Mater和Dnmt1 mRNA在绵羊卵母细胞和早期胚胎中的表达

为探讨母源基因在绵羊卵母细胞和胚胎发育过程中的表达模式,运用Real-time PCR技术研究4种母源基因:Gdf9(生长分化因子9)、Zar1(合子阻泄因子)、Mater(胚胎必要的母体抗原)及Dnmt1(DNA甲基化转移酶1)的mRNAs在绵羊GV期卵母细胞,24h成熟卵母细胞,2-细胞、4-细胞、8-细胞、16-细胞胚胎以及囊胚中的含量变化情况。结果表明:在GV期卵中Zar1、Mater、Gdf9以及Dnmt1m RNA相对含量最高(P<0.05);从2-细胞胚胎开始,4种基因的mRNA相对含量显著降低(P<0.05),各基因mRNA的含量在不同发育阶段的卵母细胞和胚胎中存在动态变化,这对卵子生长和胚胎发育有重要意义。

小鼠UGT1 A1 mRNA在慢性肝损伤时的表达

目的 探讨慢性肝损伤对小鼠尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶 (UGT ) 1A 1mRNA表达的影响。方法 通过四氯化碳灌胃建立小鼠慢性肝损伤模型 ,30只昆明鼠随机分 3组 :正常对照组 ,实验 1组 (给药 1个月时 ) ,实验 2组 (给药 2个月时 )。检测肝功能 ,并以RT PCR技术检测正常对照组与实验组肝脏UGT 1A 1mRNA表达的差异。结果 各组间UGT 1A 1mRNA表达差异有显著性 (P<0 .0 5 ) ,实验组UGT1A 1mRNA表达比正常组降低 ,且肝损伤程度越严重表达越低。结论 四氯化碳所致慢性肝损伤能降低小鼠肝UGT 1A

hTERT mRNA和MDR mRNA在人肝癌中的表达及其意义

目的 探讨hTRTmRNA及MDRmRNA在人肝细胞肝癌 (HCC )组织中的表达及其意义。方法 检测 5 8例HCC患者癌组织及癌旁组织中hTERTmRNA和MDRmRNA的表达情况。结果 在 5 8例肝癌患者癌组织及其癌旁组织中 ,hTERTmRNA阳性率分别为 44 .83 % ( 2 6/5 8)和 5 .17% ( 3 /5 8) ,差异有显著性 (P <0 .0 1) ;MDRmRNA阳性率分别为 60 .3 4% ( 3 5 /5 8)和 3 2 .76% ( 19/5 8) ,差异有显著性 (P <0 .0 1)。hTRTmRNA ,MDRmRNA在人肝癌组织中的检出率与临床分期、肝外转移、术后复发、肿瘤大小等明显相关 (均P <0 .0 5 ) ,而与肿瘤数目、血清AFP水平等无明显相关 (P >0 .0 5 )。MDRmRNA检出率与术前化疗明显相关 (P <0 .0 1) ,但与门静脉癌栓无关 (P >0 .0 5 ) ;而hTERTmRNA与术前化疗无相关 (P >0 .0 5 ) ,但与门静脉癌栓有关 (P <0 .0 5 )。结论 hTERTmRNA和MDRmRNA可能与肝细胞的恶性转化及术后复发有关 ,故可望作为预测肝癌复发。

CD44v6和p63蛋白在喉鳞状细胞癌中的表达及其意义

目的探讨CD44v6和p63蛋白表达与喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinomas,LSCC)的发生、发展和生物学意义。方法应用免疫组织化学方法,检测30例LSCC、10例不典型增生和10例正常喉黏膜组织中CD44v6和p63蛋白的表达水平,并结合临床病理特征进行分析。结果①在LSCC组织中CD44v6蛋白表达阳性率为76.7%(23/30),明显高于不典型增生和正常喉黏膜组织(40.0%,4/10,P<0.05))。②全部30例LSCC和10例不典型增生组织中p63染色均为阳性。LSCC分化程度越低,阳性细胞数越高、细胞的着色越深。正常喉黏膜组织中仅基底层及上基层细胞阳性。③p63表达与LSCC分级和淋巴结转移相关(P<0.05)。结论CD44v6和p63可能参与了调控LSCC的发生、发展过程,其高表达预示LSCC预后不良。

极低密度脂蛋白对肾小管上皮细胞人尿酸盐转运子基因表达的影响

目的观察不同浓度极低密度脂蛋白(VLDL)是否调节肾小管上皮细胞(HK-2细胞)人尿酸盐转运子(hUAT)mRNA的表达。方法根据培养液中所含VLDL浓度的不同,将HK-2细胞分为:①仅使用DMEM/F-12组(对照组);②DMEM/F-12+50μg/ml VLDL组(V1组);③DMEM/F-12+100μg/ml VLDL组(V2组);④DMEM/F-12+200μg/ml VLDL组(V3组);⑤DMEM/F-12+400μg/ml VLDL组(V4组)。每组均培养6瓶细胞。上述细胞在不同培养液中分别培养48h。采用实时荧光定量PCR检测HK-2细胞中hUAT mRNA的相对表达量(2△△Ct法)。结果所有标本均能检测到hUAT mRNA的表达,但V1～V4组hUAT mRNA表达水平均明显低于对照组,其中,VLDL最低浓度(50μg/ml)组hUAT mRNA表达水平为对照组的64%,VLDL最高浓度(400μg/ml)组hUAT mRNA表达水平仅为对照组的24%。结论VLDL下调hUAT mRNA表达,VLDL的这种作用可能与脂代谢紊乱易合并高尿酸血症有关。

心肌特异性表达腺病毒载体的构建及鉴定

目的 :构建心肌特异性表达的腺病毒载体 ,使外源基因在心肌细胞中特异性表达。方法 :将心肌特异性肌凝蛋白轻链蛋白 2 (mlc 2v)启动子克隆至腺病毒穿梭质粒 ,并将绿色荧光蛋白 (GFP)基因克隆至此质粒中 ,同源重组含GFP基因的缺陷型腺病毒 (AdmlcGFP) ,转染心肌细胞及非心肌细胞。结果 :经RT PCR分析 ,转染的心肌细胞有GFPmRNA的表达 ,而转染的非心肌细胞无GFPmRNA的表达 ;荧光显微镜下观察 ,可见转染的心肌细胞表达GFP ,而转染的的非心肌细胞不表达GFP。结论 :构建的心肌特异性表达腺病毒载体可使外源基因在心肌细胞内特异性表达。

环氧化酶-2和p63基因蛋白在食管鳞状细胞癌的表达及其临床意义

目的探讨食管鳞状细胞癌(esophageal squamous carcinoma,ESC)组织中COX-2和p63基因蛋白表达与ESC生物学行为的关系。方法应用免疫组织化学方法,检测65例ESC组织中COX-2和p63蛋白表达水平。结果在ESC中COX-2和p63表达阳性率分别为73.8%(48/65)和86.2%(56/65)。COX-2和p63表达均与肿瘤分级、浸润、淋巴结转移和预后相关。结论COX-2和p63异常表达与ESC的病理生物学行为密切相关,可作为预测ESC转移潜能和评估ESC患者预后的客观指标。

survivin和PTEN基因蛋白在食管鳞状细胞癌的表达及临床意义

目的:探讨食管鳞状细胞癌组织中survivin和PTEN基因蛋白表达与食管鳞状细胞癌生物学行为的关系。方法:应用免疫组织化学方法,检测65倒食管鳞状细胞癌组织中survivin和PTEN蛋白表达水平。结果:在食管鳞状细胞癌中survivin和PTEN表达阳性率分别为61．5％(40／65)和58．5％(38／65)。survivin和PTEN表达均与肿瘤分化、浸润、淋巴结转移和预后相美(P<0．05)。结论:survivin和PTEN异常表达与食管鳞状细胞癌的病理生物学行为密切相关,可作为是预测食管鳞状细胞癌转移潜能和评估食管鳞状细胞癌患者预后的客观指标。

初发鼻咽癌与复发鼻咽癌差异表达基因的研究

目的:通过全基因组基因芯片研究初发鼻咽癌(pNPC)与复发鼻咽癌(rNPC)之间的差异表达基因。方法:选择rNPC和pNPC组织标本,应用Affymetrix Gene1.0 ST芯片,构建表达谱,检测两者之间的差异表达基因。结果:rNPC组与pNPC组比对,发现差异基因46个,下调基因38个,上调基因8个。这些基因参与钙结合、蛋白结合、酶活性调节等过程。结论:rNPC和pNPC之间存在基因差异表达,为了解rNPC的发生机制的研究起了一定的作用。

小鼠白细胞介素23基因在毕赤酵母中的诱导表达及初步活性研究

目的:克隆小鼠白细胞介素23(mice interlecukin-23,mIL-23)基因,构建高效稳定的毕赤酵母表达菌株,并对得到的蛋白进行生物活性的初步测定。方法:采用聚合酶链式反应(PCR)技术从pcDNA3-mIL-23上分别扩增获得IL-23的两亚基p19和p40,并通过重叠PCR(over-lap PCR)技术获得含有连接子的p1940,构建pPICZαA-IL-23重组质粒;采用甲醇诱导毕赤酵母表达重组蛋白,MTT方法检测诱导表达蛋白的促淋巴细胞增殖情况。结果:SDS-PAGE分析显示在诱导24小时和36小时后的上清及24～96小时的沉淀中均可以检测到约70 kD的诱导条带。Western blot印迹法证实了重组蛋白为特异性蛋白。上清和沉淀中表达的重组蛋白IL-23能促进外周血单个核细胞的增殖,OD570 nm分别达到(0.235±0.029)和(0.216±0.035),而未刺激的对照组只有(0.135±0.008)和(0.164±0.017)。结论:成功构建出mIL-23的酵母表达载体,诱导产生的蛋白可以明显地促进外周血单个核细胞的增殖。

喉鳞状细胞癌中p63基因蛋白表达及其意义

目的:探讨p63基因蛋白表达与喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinomas,LSCC)的发生、发展的关系和生物学意义。方法:应用免疫组织化学方法,检测30例LSCC、10例不典型增生和10例正常喉黏膜组织中p63基因蛋白的表达水平。结果:全部30例LSCC和10例不典型增生组织中p63染色均为阳性。LSCC分化程度越低,阳性细胞数越高、细胞的表达强度越高。正常喉黏膜组织中仅基底层及上基层细胞阳性。p63表达与LSCC分级和淋巴结转移相关(P<0.05)。结论:p63可能参与了调控LSCC的发生、发展过程,其高表达预示LSCC预后不良。

雌激素与人尿酸盐转运子(hUAT)基因表达的相关性研究

目的观察不同浓度雌激素对肾小管上皮细胞(HK-2细胞)人尿酸盐转运子(hUAT)基因表达的调节作用。方法根据培养液中所含雌激素浓度由低到高,将HK-2细胞分为5组,每组均培养6瓶细胞。上述细胞在不同培养液中分别培养48h。采用荧光定量PCR法检测HK-2细胞中hUAT mRNA的相对表达量。结果所有标本均能检测到hUAT mRNA的表达,其中,与B0组(乙醇对照组)比较,B3(10-8mol/L)、B4(10-6mol/L)组hUAT mRNA水平明显升高(P<0.05),B1(10-12mol/L)、B2(10-8mol/L)组hUAT mRNA水平变化不明显(P>0.05)。与B1、B2组比较,B3、B4组hUAT mRNA水平明显升高(P<0.05)。B3组与B4组比较差异无统计学意义(P>0.05)。B1组与B2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。B4组hUAT mR-NA水平最高,是B0组的1.87倍。结论雌二醇可上调hUAT mRNA的表达,且可能存在相应的作用阈值。

aFGF基因转染对心肌血管生成的实验研究

目的 观察分泌型aFGF真核表达载体转染大鼠心肌细胞后 ,aFGF在体内、外的分泌表达及转染心肌细胞的移植对宿主心肌血管形成作用的影响。方法 构建分泌型aFGF真核表达载体(pCDNA3 1+SP aFGF) ,转染培养大鼠的心肌细胞 ,检测体外心肌细胞对aFGF的分泌表达 ;将转染细胞移植入同种大鼠心肌 ,检测移植细胞在体内对aFGF的表达及宿主心肌的血管生成。结果 硝酸纤维素膜点杂交和ELISA显示 ,aFGF在转染 2 4～ 96h细胞培养上清中有较高的表达 ;接受转染心肌细胞移植96h后免疫组化检查 ,发现aFGF在受体心肌内得到分泌表达 ,2 0d后组织切片发现 ,移植心肌细胞周围的心肌中有较多的新生毛细血管。结论 转染分泌型aFGF真核表达载体的心肌细胞 ,在体内、外能分泌表达aFGF ;通过心肌细胞移植 。