云南汉族人群GGCX(rs699664)基因多态性与华法林抗凝治疗剂量的相关性研究

目的：探讨γ谷氨酰羧化酶（GGCX）(rs699664)基因在云南汉族人群的分布情况及基因多态性与心脏瓣膜置换术后华法林稳定剂量的相关性，为临床应用华法林初始剂量及维持剂量提供分子遗传学依据。方法采集300例心脏瓣膜置换术后服用华法林，INR值在1.5~3.0病人的外周血，采用 Snapshot 技术检测GGCX(rs699664)基因型，研究其基因型及等位基因频率。结果300例研究对象中，280例检测出结果,共检出A和G 2种等位基因，3种基因型：纯合子A/A（24例，基因型频率为0.0857）、杂合子A/G（137例，基因型频率0.4893）、纯合子G/G（119例，基因型频率为0.425）。服用华法林剂量A/A型为3.507±1.44mg/d；A/G型为3.46士1.236mg/d；G/G型为3.092±l.O44mg/d。结论 GGCX (rs699664)基因多态性是影响云南汉族人群华法林稳定剂量的遗传因素之一。

不同CYP2C9及GGCX基因型在人工瓣膜置换术后的抗凝效果比较

目的了解不同CYP2C9及GGCX基因型对人工瓣膜置换术后抗凝效果的影响。方法选取2013年1月-2016年12月在该院心脏外科接受心脏瓣膜置换术的患者,采集服药后空腹12 h的外周静脉血3 ml进行CYP2C9和GGCX基因型检测,收集患者相关临床资料,采用SPSS 21.0软件进行数据分析。结果选取80例患者,CYP2C9基因型有2种,包括73例CYP2C9*1*1和7例CYP2C9*1*3患者;42例GGCX*A*G型和38例GGCX*G*G型患者。两种基因型患者在性别、年龄、体质指数(BMI)、凝血酶原时间(PT)、国家标准化比值(INR)值及达到稳定抗凝效果后的华法林血药浓度差异无统计学意义(P<0.05),但CYP2C9*1*1型患者INR首次达标时间>CYP2C9*1*3型患者(P=0.013),CYP2C9*1*1型患者华法林日均稳定维持剂量>CYP2C9*1*3型患者(P=0.011),GGCX*A*G型患者华法林日均稳定维持剂量>GGCX*G*G型患者(P=0.000),同时为CYP2C9*1*1型和GGCX*A*G型的患者华法林日均稳定维持剂量>其他3组(P=0.024)。CYP2C9基因型(P=0.001)和GGCX基因型是影响患者术后第6天是否能达到治疗窗的影响因素(P=0.032)。结论根据CYP2C9基因型和GGCX基因型确定个人使用剂量,可提高患者抗凝治疗效果。

新疆地区哈萨克族和汉族人群中GGCX基因多态性分析

目的探讨γ-谷氨酰基羧化酶(Gamma-glutamyl carboxylase,GGCX)基因多态位点在新疆地区哈萨克族、汉族人群中的分布特点及其差异。方法采用标准酚-氯仿法提取新疆地区哈萨克、汉族各305例健康人外周血基因组DNA,应用多聚酶链反应-限制性内切酶长度片段多态性(PCR-RFLP)技术对GGCX的2个单核苷酸位点(rs11676382和rs6751560)进行基因多态性监测,计算其基因型,并比较2个民族人群中基因多态性分布的差异。结果 rs11676382基因型CC、CG和GG在哈萨克族人群中分别有66例(21.64%)、233例(76.39%)和6例(1.97%),C和G等位基因的频率分别为59.84%和83.50%;在汉族人群中分别有209例(68.30%)、93例(30.39%)和4例(1.31%),C和G等位基因的频率分别为40.16%和16.50%。rs6751560基因型AA、AG和GG在哈萨克族人群中分别有2例(0.66%)、11例(3.61%)和292例(95.74%),A和G等位基因的频率分别为2.46%和97.54%;在汉族人群中AA、AG和GG分别有4例(1.31%)、3例(0.98%)和298例(97.70%),A和G等位基因的频率分别为1.80%和98.20%;哈萨克族人群与汉族人群rs11676382位点基因型比较差异有统计学意义(总χ2=134.9,P<0.01),显性模型CC与CG+GG、隐性模型GG与CC+CG、附加模型CG与CC+GG之间比较显示,显性模型和附加模型比较差异有统计学意义(χ2=134.4和129.9,P<0.01),等位基因C与G比较差异有统计学意义(χ2=84.3,P<0.01)。rs11676382位点隐性模型和rs6751560位点基因型及等位基因差异均无统计学意义。结论新疆地区哈萨克族与汉族人群rs11676382位点均以CC和CG基因型比较常见,C等位基因出现的频率比G等位基因出现的频率高;CC基因型是保护因素,而CG基因型是危险因素,GG基因型既不是保护因素,又不是危险因素。2个民族人群中rs6751560位点以GG基因型常见,A和G等位基因出现的频率相等。

CYP2C9、CYP4F2、GGCX和VKORC1基因多态性对房颤患者华法林使用剂量的影响

目的:探讨CYP2C9、CYP4F2、GGCX和VKORC1基因多态性对房颤患者华法林使用剂量的影响。方法:采用PCRRFLP法检测157例口服华法林抗凝治疗房颤患者CYP2C9、CYP4F2、GGCX和VKORC1基因多态性,登记并计算患者INR稳定在1.5~3.0时一周的平均日剂量。比较不同基因型房颤患者华法林日用量的差异。结果:INR稳定在1.5~3.0时,CYP2C9*1/*1个体使用华法林剂量[(2.73±0.80)mg·d^(-1)]显著高于*1/*3使用量[(1.83±0.51)mg·d^(-1)];VKORC1TT基因型携带者使用剂量[(2.56±0.79)mg·d^(-1)]显著低于CT基因携带者使用量[(3.31±0.75)mg·d^(-1)];CYP4F2 CC基因型使用剂量[(2.58±0.78)mg·d^(-1)]显著低于TT基因携带者使用量[(3.21±1.04)mg·d^(-1)];GGCX CC基因型使用剂量[(2.49±0.89)mg·d^(-1)]显著低于GG基因型使用量[(3.04±0.75)mg·d^(-1)]。多因素回归分析结果显示CYP2C9、VKORC1和GGCX与个体华法林剂量有关。结论:CYP2C9、VKORC1和GGCX基因多态性可能与个体华法林使用剂量差异有关。

转GGCX基因治疗兔骨性关节炎的体外实验研究

目的探索GGCX基因对兔骨性关节炎软骨细胞MMP13的影响及其在兔骨性关节炎软骨退变中的作用。方法取体质量(2.0±0.2)kg日本大耳兔6只,随机分为3组,每组设立一只对照兔,分别在2、4、6周使用膝前交叉韧带切断术构建模型,6周后模型兔构建成功,分离关节软骨,经消化分离后将软骨细胞接种到6孔细胞培养板,将软骨细胞分为空白组、阴性对照组(转染不含GGCX基因慢病毒)、转染组(转染含GGCX基因慢病毒)3组。转染组则均以LipofectamineTM2000为转染媒介。用PCR法及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测GGCX和MMP13的表达。结果转染组GGCX有较高的表达水平;转染组MMP13的表达水平降低,且二者与空白组及阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 GGCX基因过表达可明显降低其软骨细胞MMP13的表达,为将基因治疗运用于体外骨性关节炎提供实验基础。

新疆汉族房颤患者GGCX基因rs11676382多态性及其与华法林稳定剂量相关性研究

目的研究新疆地区汉族房颤患者GGCX基因rs11676382位点多态性及其与华法林稳定剂量的相关性。方法从长居新疆地区的汉族房颤患者中，收集200例获得华法林稳定剂量的病例资料，所有入选者均采集外周血提取基因组DNA，采用聚合酶链反应，限制性片段长度多态性技术（PCR-RF凹）检查患者GGCX基因您11676382多态性的分布。比较不同基因型受试者之间华法林用量的差异。结果200例受试者中，GGCX基因阳11676382位点CC、CG和GG基因型的例数分别为150例（82．5％）、48例（16．5％）和2例（1．0％）；C和G等位基因的频率分别为99％、1％；所选人群GGCX（rs11676382）等位基因频率和基因型频率均符合HaZy—Weinberg平衡（x^2=0．744，P=0．388），本组受试者稳定剂量范围是1．25，6．88mg／d，平均（3．22±1．12）mg／d。基因型为CC、CG和GG的受试者华法林稳定剂量分别为（5．93±1．33）mg／d、（3．22±0．88）mg／d和（3．16±1．40）mg／d。经秩和检验分析，GGCX（M11676382）多态位点与华法林稳定剂量显著相关（x^2=6．094，P=0．047）。结论获得了长居新疆地区汉族房颤患者的GGCX基因巧11676382多态性。同时发现基因型CC与高剂量相关，GG与低剂量相关，该位点可作为预测个体华法林稳定剂量的一项指标。

GGCX基因在兔骨关节炎软骨退变中的作用机制

通过将GGCX慢病毒转染软骨细胞,探讨骨关节炎患者软骨组织中γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)基因过度表达对兔骨关节炎(OA)软骨细胞分化的影响及其机制。首先从OA兔体内分离软骨细胞,用茜素红染色标记软骨细胞。然后将分离的软骨细胞分为正常对照组、GGCX过表达组和载体组3组。编码GGCX的慢病毒用于过表达GGCX,流式细胞分析检测出病毒转染后细胞凋亡。实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法用于检测GGCX、基质金属蛋白酶13(MMP13)、Ⅹ型胶原、Ⅱ型胶原、肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-1β。慢病毒编码GGCX提高了OA软骨细胞中中GGCS的表达水平,mRNA和蛋白水平都显著升高(p<0.05)。GGCX过表达显著增加Ⅱ型胶原,而mRNA和蛋白水平均降低MMP13、Ⅹ型胶原、TNF和IL-1β表达(p<0.05)。相对于载体,GGCX过表达抑制了OA软骨细胞的细胞凋亡。GGCX过表达可调节细胞外基质的平衡,促进软骨细胞蛋白多糖合成,这与细胞凋亡减少有关。

华法林使用剂量影响因素及临床应用研究进展

上个世纪50年代开始,华法林开始应用于深静脉血栓形成,房颤以及瓣膜置换术后患者的抗凝治疗,并证实是安全有效的。但是由于华法林治疗窗窄,个体间存在差异性,要达到治疗效果的华法林剂量仍然较困难。临床上通常根据国际化标准比值（INR）调整华法林药量。最近几年国内外学者一直在研究华法林的作用机制以及遗传基因学特点,并发现以及证实了基因多态性与华法林剂量的关联性,以基因多态性来预测华法林合适剂量的模式已经应用于临床。

六种基因多态性对中国汉族人群华法林稳定剂量的影响

目的评价VKORC1、CYP2C9、GGCX、PROC、EPHX1及CYP4F2基因多态性对中国汉族人群华法林稳定剂量的影响。方法随机选取488例服用华法林抗凝且国际标准化比值均稳定达标的中国汉族患者，抗凝指证包括人工瓣膜置换术后、房颤及肺血栓栓塞症，对所有入选患者进行上述6种基因多态性检测，并记录患者平均每日华法林稳定剂量、人口学信息及合并用药情况等；分析VKORC1、CYP2C9、GGCX、PROC、EPHX1及CYP4F2基因多态性、人口学信息及合并用药对华法林稳定剂量的影响。结果VKORC1和CYP2C9基因多态性共解释了50％以上的中国汉族患者华法林稳定剂量的个体差异，其影响程度大于人口学特征、合并用药等因素；CYP4F2基因多态性仅能解释1％中国汉族患者的华法林稳定剂量的个体差异；GGCX、PROC及EPHX1基因多态性不影响中国汉族患者的华法林稳定剂量。结论VKORC1和CYP2C9基因多态性是影响中国汉族人群华法林稳定剂量的主要遗传因素。

γ-谷氨酰羧化酶基因过表达对兔骨关节炎软骨细胞分化的影响

通过将GGCX慢病毒转染软骨细胞,探讨骨关节炎患者软骨组织中γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)基因过度表达对兔骨关节炎(OA)软骨细胞分化的影响及其机制。本研究首先从OA兔体内分离软骨细胞,用茜素红染色标记软骨细胞。然后将分离的软骨细胞分为正常对照组、GGCX过表达组和载体组3组。编码GGCX的慢病毒用于过表达GGCX,流式细胞分析检测出病毒转染后细胞凋亡。实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法用于检测GGCX、基质金属蛋白酶13 (MMP13)、Ⅹ型胶原、Ⅱ型胶原、肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-1β。慢病毒编码GGCX提高了OA软骨细胞中中GGCS的表达水平,mRNA和蛋白水平都显著升高(p<0.05)。正常对照组的凋亡率为26.12%,载体组的凋亡率为26.12%左右,GGCX过表达组的凋亡率为18.17%,GGCX过表达可明显减少软骨细胞细胞凋亡(p<0.05)。GGCX过表达显著增加Ⅱ型胶原,而mRNA和蛋白水平均降低MMP13、Ⅹ型胶原、TNF和IL-1β表达(p<0.05)。相对于载体,GGCX过表达抑制了OA软骨细胞的细胞凋亡。GGCX过表达可调节细胞外基质的平衡,促进软骨细胞蛋白多糖合成,这与细胞凋亡减少有关。

先天性维生素K依赖性凝血因子缺乏症1细胞诊断体系的构建

目的:建立可用于确诊先天性维生素K依赖性凝血因子缺乏症1(vitamin K-dependent coagulation factor deficiency 1,VKCFD1)疾病的细胞体系。方法:在稳定表达报告基因FIX-Gla-PC的HEK293细胞中,应用CRISPR/Cas9技术敲除GGCX基因;通过ELISA、DNA测序、Western印迹等方法鉴定GGCX基因敲除的单克隆细胞。用快速点变异的方法构建致病性GGCX变异体质粒;用ELISA方法检测GGCX变异对报告基因的影响。结果:首先用ELISA方法筛选到两株报告基因无活性的单克隆细胞;之后DNA测序结果和Western印迹验证GGCX基因发生了编辑和敲除;最后通过转染野生型GGCX基因,可以恢复报告基因的活性,提示成功筛选到两株GGCX基因敲除的单克隆细胞。在筛选到的细胞株中转染已知可导致VKCFD1的GGCX变异体,发现报告基因活性在致病性变异体中显著降低。结论:成功构建了检测GGCX活性的细胞体系,该体系可以用于诊断GGCX变异导致的VKCFD1。

短刺加电针法对膝骨关节炎兔膝关节软骨修复的影响

目的:观察短刺加电针法对膝骨关节炎兔软骨γ-谷氨酰基羧化酶(GGCX)、基质金属蛋白酶(MMP)13及血清非羧化基质GLA蛋白(ucMGP)的影响,探讨短刺加电针法对软骨组织的修复作用。方法:新西兰大白兔随机分为正常组10只和造模组30只,造模组动物采用Hulth-Telhag法手术复制膝关节炎模型,将造模成功的动物随机分为模型组、短刺组、普通针刺组,每组10只。短刺组取左侧"内膝眼""外膝眼""阴陵泉""足三里""梁丘",采用短刺法加用电针,普通针刺组常规针刺以上穴位加用电针,均每日治疗1次,每次20min,5d为一疗程,共4个疗程。采用蛋白免疫印迹法检测软骨细胞中GGCX、MMP 13的蛋白表达;免疫组化法检测GGCX的活性;酶联免疫吸附测定法检测血清ucMGP的含量。结果:与正常组相比,模型组膝关节软骨中MMP 13、血清ucMGP表达明显提高(P<0.01,P<0.05),而GGCX表达量下降(P<0.01);与模型组相比,短刺组和普通针刺组MMP 13、ucMGP表达明显降低(P<0.01,P<0.05),而GGCX表达升高(P<0.01);与普通针刺组相比,短刺组MMP 13、ucMGP表达明显降低(P<0.01,P<0.05),而GGCX表达升高(P<0.01)。结论:普通电针法与短刺加电针法均可促进膝关节软骨细胞修复,且短刺法有一定的优势,其治疗作用可能与上调GGCX表达,促进MGP羧基化,抑制MMP 13表达有关。