百合萜烯合成相关基因LiGGPPS大小亚基基因的克隆、表达及功能分析

香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)是调节萜类化合物生物合成的关键酶,为了研究GGPPS基因在百合萜类物质合成中的作用,本试验以‘西伯利亚’百合(Lilium‘Siberia’)为试材,克隆了GGPPS大亚基(LiGGPPS.LSU)和小亚基(LiGGPPS.SSU)基因,并分析其表达和功能。通过生物信息学分析、相对表达量分析、荧光定量PCR、亚细胞定位、基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)预测并验证其特征及功能,揭示其表达模式。结果表明,LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU分别为1 100 bp和1 040 bp, LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU的氨基酸序列与其他物种的GGPPS.LSU和GGPPS.SSU的氨基酸序列具有较高的一致性,系统进化树显示它们分别与薯蓣(Dioscorea cayenensis subsp.rotundata)和深圳拟兰(Apostasia shenzhenica)亲缘关系最近。LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU基因均定位在叶绿体中,表达量随百合的生长发育呈现先上升后下降的趋势。LiGGPPS.LSU在花被片中高量表达,LiGGPPS.SSU在花药中显著高量表达。VIGS试验显示芳樟醇、罗勒烯、月桂烯释放量下降。LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU基因对百合花香单萜类物质合成具有重要作用,本试验为进一步研究百合GGPPS以及相关代谢途径提供理论基础。

丹参SmGGPPS3基因的克隆及表达分析

香叶基香叶基焦磷酸合酶(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)是植物细胞二萜类物质合成的重要调节靶点。本研究从药用植物丹参中克隆了一条新的GGPPS基因(SmGGPPS3),基因全长2908 bp,包含一个931 bp的内含子和一个960 bp的编码序列。推测的氨基酸序列与蓖麻、橡胶、拟南芥等植物GGPPS一致性达到67%以上。实时定量PCR结果显示,SmGGPPS3基因在丹参不同发育时期不同器官中表达差异显著,同时受茉莉酸甲酯和病原菌的诱导。遗传互补实验也表明,SmGGPPS3编码蛋白具有GGPP合酶的活性。

曼地亚红豆杉植株中GGPP合成酶的克隆与分析

从 5年生曼地亚红豆杉 (Taxusmedia)的当年生新鲜枝叶中提取分离出mRNA ,然后根据已知植物的牛儿基牛儿基焦磷酸合成酶基因 (GGPPS基因 )DNA序列保守区设计特异简并引物。RT PCR获得了一条大小约 60 0bp的扩增谱带 ,回收该特异谱带并进行TA克隆 ,蓝白斑筛选 ,得到若干阳性克隆。经过质粒大小比较和PCR验证后 ,进行序列测定和同源性比较。发现该序列属于GGPP合成酶的片断 ,与Taxuscanadensis (AAD 1 60 1 8 1 )和Abiesgrandis (AAL1 761 4 2 )的GGPP合成酶相应区段的氨基酸序列一致性为 98%和 86%。蛋白质序列分析发现该序列含有一个特征的异戊二烯合成酶保守的结构域。进化树分析表明 ,曼地亚红豆杉GGPPS在进化上位于植物类 ,靠近古细菌类。曼地亚红豆杉GGPPS基因的克隆为研究红豆杉生产紫杉醇的分子机理和转基因植株的构建奠定了良好的基础。

南方红豆杉GGPP合酶基因的克隆与生物信息学分析

根据GeneBank中公布的GGPPS基因保守区设计特异引物,克隆南方红豆杉GGPPS基因的DNA和cDNA序列,并通过生物信息学方法对其核苷酸序列和蛋白质结构进行分析预测。结果表明,GGPPS基因DNA和cDNA序列都为1 182 bp,DNA序列中无内含子,cDNA序列为一个编码393个氨基酸残基的开放式阅读框;GGPPS的理论相对分子质量为42 590,等电点为5.68。核苷酸同源性分析显示,它与Taxus canadensis(AF081514)同源性为98.8%;推导出的氨基酸序列与Taxus canadensis(AAD16018)同源性达99.0%。利用Protparam、SignalP、ProtScale、SOPMA、Swiss-Modeling、Scan Prosite和MEGA4.0等生物信息学工具分别对其理化性质、信号肽、疏水性、亲水性、二级结构、三级结构和进化树进行分析,为其功能研究和生物合成紫杉醇研究提供分子基础。

银杏GGPPS转运肽与GFP融合基因表达载体的构建

[目的]构建银杏GGPPS转运肽与GFP融合基因表达载体。[方法]以银杏为材料,采用DNA重组技术克隆GGPPS基因质体转运肽(TP)序列,并将其与高效植物表达载体p1304+连接形成融合表达载体(p1304+-TP);冻融法转化根瘤农杆菌EHA105,构建工程菌(EHA105-p1304+-TP)。[结果]成功构建了银杏GGPPS转运肽与GFP融合基因表达载体及农杆菌工程菌。[结论]为进一步研究TP转运肽的亚细胞定位奠定基础,有助于阐明银杏内酯前体生物合成关键步骤的分子机理,同时为银杏内酯的代谢工程研究提供重要依据。

马尾松GGPPS基因克隆及序列分析

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)是萜烯类物质合成的关键酶之一,本研究通过同源序列检索分析设计引物,从马尾松幼苗针叶组织中克隆到其GGPPS基因,命名为Pma GGPPS,该基因c DNA长1 143bp,开放阅读区编码380个氨基酸。Pma GGPPS编码的蛋白质序列分析显示具有Trans IPPS结构域及FARM、SARM两个富含天冬氨酸区域,序列特点与GGPPS蛋白的酶学功能相符。同源性分析结果显示Pma GGPPS核酸序列与其他两种松属植物GGPPS基因同源性达到99%以上,Pma GGPPS编码蛋白与挪威云杉等植物中GGPPS蛋白同源性也在69%以上。对Pma GGPPS编码蛋白进行理化性质及结构的生物信息学分析,结果显示该蛋白为一种无信号肽、无跨膜区的碱性蛋白质,二级结构由16段α-螺旋组成,三级结构同源建模显示与欧薄荷的异聚牻牛儿基焦磷酸合酶大亚基同源性最高。系统进化树分析显示该蛋白与红豆杉、银杏亲缘关系较近。本研究中克隆得到Pma GGPPS基因为深入研究其在松脂合成的影响奠定了基础,同时根据GGPPS基因设计荧光定量引物并优化反应条件,为下一步研究基因表达水平与产脂力关系提供了理论依据和技术参考。

能源橡胶草GGPPS基因启动子的克隆及瞬时表达研究

以多年生宿根型草本植物橡胶草为材料,根据已获得的橡胶草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)基因序列设计引物,采用TAIL-PCR扩增到GGPPS基因5′上游大小为1131bp的序列。采用PlantCare和PLACE软件分析,表明该序列不仅具有启动子的基本元件,同时还有与多个器官特异表达元件以及与胁迫相关的顺式作用元件,命名为pTkGGPPS(GenBank:KT901796)。将该序列代替pCAMBIA1304质粒上的CaMV 35S启动子序列,以GFP基因作为报告基因,构建pCAMBIA1304-pTkGGPPS-GFP植物表达载体,利用农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞,结果表明,该启动子能够驱动GFP基因表达,具有一定的活性。TkGGPPS基因启动子克隆及瞬时表达为橡胶草中橡胶合成及组织特异性研究奠定了基础。

植物GGPPS基因研究进展

香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)是植物萜类物质合成的一个重要调节靶点。目前已经在多种植物中开展了该基因的克隆和功能分析。对GGPPS基因及蛋白结构和生物学功能的最新研究进展进行了综述,为其在植物遗传育种方面的应用提供参考。

榛子产紫杉醇内生真菌Penicillium aurantiogriseum中GGPP合酶基因的克隆与表达

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶是产紫杉醇内生真菌紫杉醇合成下游途径中的关键步骤之一,在榛子产紫杉醇内生真菌中进行紫杉醇生物合成研究时首先要确认GGPP合酶的存在。该研究通过RT-PCR方法克隆得到了榛子产紫杉醇内生真菌Penicillium aurantiogriseum中GGPP合酶基因Pa GGPPS(Gen Bank登录号为KM881430)的c DNA开放阅读框(Open reading frame,ORF)。利用生物信息学方法,我们分析了该基因的序列,并对其编码的氨基酸序列进行了预测。结果发现该基因ORF长度为1 113 bp,预计蛋白分子量为40.98k D,等电点为6.168,表明该蛋白呈酸性。对其进行亲疏水性分析发现肽链整体呈现为亲水性。Pa GGPPS的主要二级结构元件为α-螺旋,并且包含一个异戊二烯类化合物合酶功能域。对榛子产紫杉醇内生真菌与其他物种的GGPPS进行氨基酸同源性分析,发现其与娄地青霉、曲霉菌和费氏新萨托菌的一致性较高,分别为94%、76%和76%。进化树分析表明来自动物、真菌和酵母的GGPPS聚为一类,来自植物的GGPPS聚为一类,其中榛子产紫杉醇内生真菌的GGPPS和青霉菌的进化关系最近,与植物的GGPPS的进化关系最远。对其进行基础生物信息学分析后,我们构建了原核表达载体,成功诱导其表达并得到可溶性蛋白。该研究结果为下一步深入研究GGPPS基因在内生真菌Penicillium aurantiogriseum紫杉醇合成途径中的作用及和构建高产紫杉醇基因工程菌株奠定了一定的基础。

银杏GGPPS转运肽与GFP融合基因表达载体的构建(英文)

[目的]构建银杏GGPPS转运肽与GFP融合基因表达载体。[方法]以银杏为材料,采用DNA重组技术克隆GGPPS基因质体转运肽(TP)序列,并将其与高效植物表达载体p1304+连接形成融合表达载体(p1304+-TP);冻融法转化根瘤农杆菌EHA105,构建工程菌(EHA105-p1304+-TP)。[结果]成功构建了银杏GGPPS转运肽与GFP融合基因表达载体及农杆菌工程菌。[结论]为进一步研究TP转运肽的亚细胞定位奠定基础,有助于阐明银杏内酯前体生物合成关键步骤的分子机理,同时为银杏内酯的代谢工程研究提供重要依据。

15种药用植物的GGPPS蛋白生物信息学分析

利用生物信息学的方法对15种药用植物GGPPS蛋白的理化性质、亚细胞定位、功能结构域、二级结构以及三级结构等方面进行预测和分析。结果表明,药用植物GGPPS蛋白是一种亲水性、不稳定的非跨膜蛋白,都具有一个相同的功能结构域polyprenyl-synt。GGPPS蛋白二级结构与三级结构的主要结构元件是α-螺旋和无规则卷曲。同源性分析表明GGPPS蛋白具有很高的保守性,雷公藤(Tripterygium wilfordii)GGPPS蛋白与其余14种植物的亲缘关系较远。

GGPPS基因干扰腺病毒载体的构建及鉴定

构建GGPPS基因干扰腺病毒质粒载体并加以鉴定.根据GGPPS基因序列设计GGPPS干扰序列引物,定向克隆至穿梭载体pshuttle-H1的BglⅡ和HindⅢ位点,PmeⅠ酶切线性化的pShuttle-H1-SiGGPPS干扰质粒,并与腺病毒载体(pAdEasy-1质粒)共同转化E.coli BJ5183感受态细菌,产生重组腺病毒载体.用PacⅠ酶切线性化的回收质粒,转染293A细胞包装腺病毒颗粒,在倒置显微镜下观察细胞CPE,用TCID50法测定病毒颗粒的浓度,并初步观察病毒感染PC12细胞对目的基因的干扰效率.经酶切鉴定、测序证实成功构建GGPPS基因干扰腺病毒载体.包装的腺病毒浓缩悬液滴度为1.995×107PFU/mL.GGPPS在人中具有保守性,该病毒能在人源的WRL-68细胞中成功表达,并且对GGPPS基因干扰效率达70%以上.

金锡杉中紫杉醇合成途径GGPPS和TDC1的基因序列与时空表达分析

紫杉醇是一种具有高效抗癌特性的二萜类物质,其生物合成途径一直是科学家们研究的热点。‘金锡杉’是南方红豆杉变种,相较于原种含有更加丰富的紫杉醇,因此是一种重要的遗传资源。本研究以‘金锡杉’为材料,运用生物信息学方法分析了紫杉醇合成途径中两种关键酶基因GGPPS(geranylgeranyl diphosphate synthase mRNA)和TDC1(taxadiene synthase mRNA)的序列结构,并采用半定量RT-PCR技术分析了它们的时空表达模式。生物信息学分析结果显示,基因GGPPS全长为1889 bp,其编码的蛋白质GGPPS是一种不稳定的亲水性胞内酶。基因TDC1全长为2700 bp,其编码的蛋白质TS是一种不稳定的脂溶性胞内酶。时间表达分析结果显示,GGPPS和TDC1在春季和夏季时期都有表达且均在春季表达量最高,该结果表明GGPPS和TDC1的表达受到季节更迭的影响。组织表达分析结果显示,GGPPS和TDC1在‘金锡杉’的树叶、树皮、树枝和果实中都有表达且两个基因在不同组织中呈现不同表达趋势。GGPPS在树叶中表达量较高,而TDC1在树皮中表达量较高,这些结果表明GGPPS和TDC1的表达同样具有组织特异性。该研究为寻找提高红豆杉中紫杉醇含量的方法提供了一定的理论基础。

山鸡椒LcGPPS表达模式及其与LcGGPPS蛋白互作分析

[目的]鉴定与山鸡椒精油合成关键酶香叶基二磷酸合酶(LcGPPS)的互作蛋白,为揭示山鸡椒精油主要成分单萜物质的合成机理奠定基础。[方法]通过本地Blast搜索山鸡椒果实转录组数据库,采用RT-PCR克隆山鸡椒GPPS基因(编码异质GPPS小亚基的LcGPPS.SSU1)和山鸡椒GGPPS基因(LcGGPPS1和LcGGPPS3);利用qRTPCR分析其组织特异性表达模式,通过蛋白互作预测和酵母双杂实验验证LcGPPS.SSU1分别与LcGGPPS1和LcGGPPS3的互作关系。[结果]克隆得到LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1和LcGGPPS3 3条基因序列,基因表达模式分析表明,LcGPPS.SSU1特异性地在花和果实中高水平表达;蛋白结构互作预测结果显示,LcGPPS.SSU1可以分别与LcGGPPS1和LcGGPPS3互作形成异质二聚体;经过酵母双杂交实验验证发现,仅LcGGPPS3能与LcGPPS.SSU1发生互作。[结论]LcGPPS.SSU1通过与LcGGPPS3蛋白发生互作从而在山鸡椒萜类合成途径中发挥作用,为深入研究山鸡椒萜类合成机制提供参考。

海南粗榧GGPPs基因克隆与诱导表达分析

濒危植物海南粗榧富含多种抗癌活性次生代谢产物。为研究这些产物的生物代谢途径和表达调控,通过同源克隆和RACE技术获得了海南粗榧紫杉醇生物合成途径中通用前体牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶(GGPPs)基因全长并进行了生物信息学分析。该基因命名为CmGGPPs(GenBank登录号:JX971119),并进一步利用不同激发子诱导研究了该基因对不同逆境信号的响应情况。结果表明:海南粗榧GGPPs基因cDNA全长1694bp,包含一个1182bp的ORF框,编码393个氨基酸;预测该基因编码蛋白质分子量为42.91kD,其等电位为7.12。通过BLAST比对结果分析,海南粗榧GGPPs基因全长核苷酸序列与红豆杉科植物的同源性最高可达91%,氨基酸序列有89%的相似性。同时,GGPPs基因氨基酸序列同其他植物也有较高的同源性。用不同类型激发子处理发现,GGPPs在诱导后表达量均上升,但不同激发子诱导的基因表达强度和速率存在明显区别。

桃果实PpFPPS和PpGGPPS基因的克隆及表达分析

本试验以桃果实为试验材料,利用RT-PCR结合RACE技术克隆获得法尼基焦磷酸合成酶(FPPS)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)基因的全长c DNA序列,分别命名为Pp FPPS和Pp GGPPS,并对它们进行生物学信息及表达分析。结果表明,Pp FPPS全长1 501 bp,开放阅读框1 029 bp,编码342个氨基酸;Pp GGPPS全长1 547 bp,开放阅读框1 113 bp,编码370个氨基酸。进化树分析表明,Pp FPPS与苹果和梨的亲缘性较高;Pp GGPPS与橡胶树的亲缘性较高。蛋白质序列分析表明,Pp FPPS和Pp GGPPS均含有5个保守域和2个天冬氨酸富集区(FARM和SARM),同属反式-异戊烯转移酶家族。实时荧光定量PCR分析表明,随着果实成熟度的提高,Pp FPPS和Pp GGPPS基因在桃果实果皮和果肉中的表达量总体上呈先增加后降低的趋势,并在膨大和硬熟期达到最大值。果实膨大期后,Pp FPPS和Pp GGPPS基因在果皮中的表达显著高于果肉,这可能是桃果实成熟后期果皮类胡萝卜素含量高于果肉的重要原因。本研究结果为进一步深入研究桃果实类胡萝卜素生物合成的分子机理奠定了理论基础。

噬夏孢欧文氏菌GGPP合成酶与八氢番茄红素合成酶相互作用的研究

GGPP合成酶与八氢番茄红素合成酶是噬夏孢欧文氏菌类胡萝卜素合成代谢中的两个关键酶。本研究将编码GGPP合成酶与八氢番茄红素合成酶的基因crtE和crtB共转化大肠杆菌或将crtE、crtB及编码八氢番茄红素脱氢酶的crtI共转化大肠杆菌,IPTG诱导其表达,然后利用亲和层析、凝胶过滤层析纯化重组蛋白。Western blotting分析结合N-末端序列分析表明,GGPP合成酶与八氢番茄红素合成酶以两种复合体的形式存在,而八氢番茄红素脱氢酶则不能与这两种酶形成稳定的复合体。

烟草NtGGPPS 3基因的亚细胞定位和组织表达分析

为研究烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS 3在烟草萜类物质合成中的功能,构建NtGGPPS 3与GFP融合蛋白的植物表达载体,并通过基因枪法瞬时转化烟草悬浮细胞BY2,研究该基因的亚细胞定位情况,并对该基因在烟草不同生育期不同器官中的表达量进行分析。结果表明:NtGGPPS 3定位在烟草的叶绿体和质膜上;NtGGPPS 3基因在普通烟草主要生育期各组织中均表达,在叶片中表达量较高,在打顶期的茎中表达量明显上升。表明,该基因可能参与叶绿素、类胡萝卜素和质体醌等与光合作用相关萜类化合物的合成,也可能参与激素和防御相关的萜类物质合成。

GGPPS多克隆抗体的制备与鉴定

构建人香叶基香叶基二磷酸合成酶基因(GGPPS)原核表达载体,制备兔抗人GGPPS多克隆抗体.利用DNA重组技术构建原核表达载体pGEX-4T-GGPPS,诱导表达GGPPS融合蛋白,分离纯化该融合蛋白后,作为免疫原免疫家兔制备多克隆抗体.成功构建了pGEX-4T-1-GGPPS原核表达载体,转化Rosetta菌株后可高效表达GGPPS融合蛋白,成功制备GGPPS多克隆抗体,间接ELISA法测定抗体效价为1∶32000,并且抗体具有良好特异性.成功克隆GGPPS基因并制备了特异性的兔抗人GGPPS多克隆抗体,为进一步研究GGPPS的功能奠定了基础.

重组GGPPS腺病毒载体的构建及其调节肝星状细胞活化的研究

目的:构建携带人源ggpps基因的重组腺病毒并用其研究GGPPS对人肝星状细胞的活化作用.方法:利用PCR方法扩增ggpps基因片段,并亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成穿梭质粒pAdTrack-CMV-GGPPS.测序正确后,经PmeI单酶切线性化的pAdTrack-CMV-GGPPS与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1用电穿孔法共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组.经PacI酶切鉴定正确后,用磷酸钙法转染QBI-293A细胞,包装成重组体腺病毒Ad-GGPPS颗粒.利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中GFP报告基因的表达,观察重组腺病毒的产生.用TCID50法测定病毒颗粒的浓度,并用免疫蛋白印迹和实时荧光定量PCR方法鉴定目的基因的表达.然后利用该病毒感染人肝星状细胞LX-2,观察对肝星状细胞的活化以及细胞外基质合成的影响.结果:成功地构建了携带ggpps基因的重组腺病毒,得到的病毒滴度经TCID50法检测为2.5×109PFU/mL.该病毒能够在人源的肝脏细胞中成功表达GGPPS蛋白.在LX-2细胞中过量表达GGPPS可以促进肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)转分化成表达平滑肌肌动蛋白α(Alpha-Smooth muscle actin,α-SMA)的肌成纤维细胞(Myofibroblast,MF),同时检测到胞外基质成分纤连蛋白(Fibronectin,FN)的表达量显著增加.结论:成功构建的重组GGPPS腺病毒能促进肝星状细胞的活化.