大鼠GLUT3基因启动子区荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定

目的:克隆大鼠葡萄糖转运体3(glucose transporter 3,GLUT3)基因启动子区,并构建其萤火虫荧光素酶报告基因载体。方法:在对大鼠GLUT3基因5′侧翼区进行详尽生物信息学特征分析后,设计相应引物,用PCR的方法从大鼠基因组中扩增出GLUT3基因5′侧翼区-1037～155bp段长为1 292bp的启动子区(以翻译起始点ATG为+1),再用定向克隆的方法将这一启动子区片段定向重组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-basic)中,构建出包含大鼠GLUT3基因启动子区的萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-GLUT3),电泳与测序鉴定,最后再将pGL 3-GLUT3与内参pRL-TK用脂质体转染的方法瞬时共转染PC12和原代培养的神经元中,通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定pGL 3-GLUT3的启动子活性,并用独立样本t检验方法进行统计分析。对照组共转染pGL3-basic与内参pRL-TK。结果:构建出荧光素酶报告基因载体pGL3-GLUT3。与转染空质粒pGL3-basic组相比,原代神经细胞中转染pGL3-GLUT3组荧光素酶活性升高(5.182 9±0.264 8 vs 2.893 1±0.775 4,P=0.008),在PC12细胞中转染pGL3-GLUT3组荧光素酶活性也升高(2.797 7±0.512 0 vs 1.179 8±0.312 5,P=0.010)。结论:成功克隆GLUT3基因启动子区,并构建出包含GLUT3基因启动子片段的荧光素酶报告基因载体,并且在PC12和原代培养的神经元中pGL 3-GLUT3可以表现出启动子活性。这为后续大鼠GLUT3基因转录调控研究提供研究素材。

大鼠GLUT3基因第一外显子5′侧翼区碱基序列的生物信息学分析

目的:对大鼠GLUT3基因第一外显子5′侧翼转录调控区的碱基序列进行生物信息学分析,为后续的GLUT3基因的转录调控研究奠定基础。方法:通过搜索网络数据库,得到GLUT3基因现有的转录本序列以及翻译起始点上游6kb的序列。运用CpG island searcher,methprimer等软件对上述序列进行分析,预测出该段序列潜在的CpG岛,运用FirstEF、NNPP等软件分析可能的启动子区域以及运用Matlspector、TFSEARCH和TFBIND等软件分析潜在的转录因子结合位点。结果:GLUT3基因的启动子可能位于翻译起始点上游-795～-226bp(以翻译起始点ATG为+1),第一外显子位于-285～+15bp,在这段序列上存在包括SP1、CREBP、P300、AML1、NF1等约110多种转录因子的潜在结合位点。结论:对大鼠GLUT3基因第一外显子5′侧翼转录调控区序列进行了初步的生物信息学分析,为后续试验提供了研究基础。

大鼠GLUT3启动子的克隆及其缺糖调控活性的测定

目的:构建葡萄糖转运体3(GLUT3)启动子的报告基因,并在正常和缺糖情况下检测其转录活性。方法:使用生物信息学软件预测了GLUT3的启动子序列,长度1 292 bp,包含第1个外显子,通过PCR及双酶切方法,从大鼠全血基因组DNA中获得GLUT3基因编码序列,包含GLUT3启动子序列,然后克隆到报告基因pGL3-Basic载体上,构建GLUT3启动子的报告基因;用脂质体转染法将pGL3-GLUT3与胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(pRL-TK)共转染入PC12细胞中,以pRL-TK载体作内参照,分别给予正常和缺糖培养,采用双萤光素酶报告系统评估GLUT3启动子的活性。结果:经PCR方法扩增出GLUT3启动子序列,测序与GenBank序列一致;转染后检测显示,该pGL3-GLUT3明显具有转录活性,而且在缺糖24 h情况下其双萤光素酶活性有明显升高。结论:成功构建出GLUT3启动子报告基因,pGL3-GLUT3表现出很好的缺糖诱导活性,缺糖24 h是研究pGL3-GLUT3在缺糖情况下转录调控很有意义的时间点。