GnT-IVa对京尼平苷调节胰腺β细胞GLUT2糖基化及葡萄糖摄取的影响

N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-4a(N-acetylglucosamine transferase-4a,GnT-IVa)是胰岛β细胞中葡萄糖转运蛋白2(glucose transporter 2,GLUT2)形成N-糖链分支复合物、使其驻留在细胞膜表面完成正常生理功能所必需的糖基转移酶。课题组前期研究发现,京尼平苷可快速调节胰腺β细胞中GLUT2糖基化和葡萄糖摄取,但GnT-IVa是否与其有直接的联系,还有待研究。首先利用siRNA干扰INS-1细胞GnT-IVa表达,随后分析京尼平苷对GLUT2糖基化、葡萄糖摄取、代谢以及葡萄糖诱导胰岛素分泌(glucose-stimulated insulin secretion,GSIS)的影响。结果证实,在GnT-IVa干扰的INS-1细胞中,京尼平苷对GLUT2糖基化的影响、葡萄糖吸收、ATP生成以及GSIS被明显抑制。研究结果提示,GnT-IVa可能在京尼平苷调节胰岛β细胞GLUT2糖基化、葡萄糖摄取、代谢和GSIS过程中有重要作用。

胃癌中β3GnT8的表达及临床意义

目的探讨β3GnT8在胃癌中的表达及临床意义。方法制作胃癌组织芯片,采用免疫组化En Vision法检测β3GnT8、MMP-2、PCNA在胃癌及癌旁正常组织中的表达,并分析各蛋白之间表达的相关性及其与临床病理特征的关系。结果β3GnT8、MMP-2、PCNA在胃癌组织中的表达均高于癌旁正常组织(P=0. 001)。β3GnT8表达与胃癌临床分期(P=0. 001)、浸润深度(P=0. 011)、淋巴结转移(P=0. 003)呈显著正相关。β3GnT8表达与MMP-2(r=0. 703,P=0. 001)、PCNA的表达(r=0. 231,P=0. 024)呈显著正相关,β3GnT8阳性组的总体生存时间较阴性组显著缩短(χ2=3. 957,P=0. 047)。结论β3GnT8在胃癌中的表达增高,具有促进胃癌侵袭、转移的作用,与胃癌患者的不良预后有关。

免疫磁珠联合RT-PCR检测胃癌肿瘤标志物α4GnT

目的:研究α4GnT mRNA的转录本在胃癌患者和消化性溃疡患者外周血中的表达,并分析其在胃癌及消化性溃疡两种疾病间的差别及与胃癌预后的关系。方法:免疫磁珠分选25例胃癌患者及10例消化性溃疡患者外周血中上皮来源的细胞联合RT-PCR法检测α4GnT mRNA的转录本。结果:α4GnT mRNA在胃癌与消化性溃疡患者中阳性率分别60%(15/25)和40%(4/10),两者之间的差异无显著性(P>0.05)。α4GnT mRNA在早期胃癌与进展期胃癌患者中阳性率分别17%(1/6)和79%(15/19),两者之间的差异有显著性(P<0.05)。结论:运用免疫磁珠联合RT-PCR检测外周血肿瘤标志物α4GnT在鉴别胃癌与消化性溃疡方面无意义,但可作为预测胃癌预后的指标之一。

shRNA沉默GnT-Ⅴ基因表达对前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响

目的构建针对N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ(GnT-Ⅴ)的小片段发夹状RNA(shRNA)表达质粒,研究shRNA表达质粒沉默GnT-Ⅴ基因后对前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响。方法设计针对GnT-Ⅴ基因的小干扰RNA(siRNA)靶序列,构建shRNA表达载体并转染PC-3细胞,通过G418筛选,建立稳定表达GnT-Ⅴ基因的细胞株,采用RT-PCR和蛋白质印迹检测GnT-ⅤmRNA和蛋白的表达,并通过CCK-8增殖实验、流式细胞仪评价GnT-ⅤshRNA对前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响。结果成功构建了GnT-ⅤshRNA表达质粒,且该质粒明显下调GnT-Ⅴ的表达;PC-3细胞GnT-Ⅴ/1079的mRNA和蛋白质水平的抑制率分别为76.5%和67.0%,对PC-3细胞呈明显抑制效应;CCK-8增殖实验显示,与对照组相比,PC-3GnT-Ⅴ/1079的增殖受到明显抑制(P<0.01),以48h为著;流式细胞仪检测结果表明,PC-3GnT-Ⅴ/1079的凋亡率明显增加(P<0.05)。结论 shRNA GnT-Ⅴ能显著降低GnT-Ⅴ基因的表达水平,从而有效抑制PC-3细胞增殖,并促进细胞凋亡,该GnT-Ⅴ的siRNA序列可能成为治疗前列腺癌的有效靶点。

糖基转移酶β3GnT8/β3GalT7在多种肿瘤细胞中的表达

目的:探讨一种新的糖基转移酶β3GnT8/β3GalT7在多种肿瘤细胞中的mRNA表达情况。方法:运用半定量RT-PCR方法研究人β3GnT8/β3GalT7基因在11种恶性肿瘤细胞中的表达谱。结果:β3GnT8/β3GalT7基因在多种肿瘤细胞株中都有表达,在A549细胞中的表达最高,在SGC7901细胞中中度表达,在白血病细胞中的表达较低。结论:β3GnT8/β3GalT7基因在11种肿瘤细胞中的表达有显著差异。

β3GnT2、β3GnT8真核表达载体的构建及胃癌AGS、胶质瘤U251细胞株中β3GnT8 cDNA SNP的分布

目的β3GriT2和β3GriT8的克隆及真核表达载体的构建。方法RT-PCR法检测β3GnT2、β3GnT8在胃癌、胶质瘤、乳腺癌三类癌细胞株中的表达；PCR扩增带酶切位点β3GnT2、β3GnT8全长编码片段并构建真核表达载体βEGFP-C1-B3GnT2，βEGFP-C1-β3GnT8。结果β3GnT2、β3GnT8在上述癌细胞株中均有表达；带酶切位点β3GnT2、β3GnT8全长编码片段成功扩增并连接至pEGFP-C1载体上；胃癌AGS、胶质瘤U25l细胞株中β3GnT8 cDNA经测序鉴定存在4个一致的SNP位点。结论母βGnT2、β3GnT8共同表达于多种癌细胞株中；成功克隆β3GnT2、β3GnY8全长编码片段并构建真核表达载体βEGFP-C1-β3GnT2、βEGFP-C1-β3GnT8；发现胃癌AGS、胶质瘤U251细胞株中β3GnT8 cDNA SNP位点4个，为进一步的功能研究奠定了基础。

c-jun siRNA的构建及其对胃癌细胞株SGC7901中β3GnT8基因表达的影响

目的 构建c-jun干扰载体,有效沉默胃癌SGC7901细胞株中的c-jun基因表达,研究其对胃癌SGC7901细胞株中β3GnT8基因表达的影响.方法 ①利用互联网资源针对c-jun基因的靶序列设计合成四条siRNA,将四条siRNA插入到RNA干扰载体pGPU6/GFP/Neo中构建成四条干扰载体.②将构建好的c-jun siRNA载体质粒pGPU6/GFP/Neo-sic-jun-1949、pGPU6/GFP/Neo-sic-jun-1050、pGPU6/GFP/Neo-sic-jun-1111、pGPU6/GFP/Neo-sic-jun-1276通过阳离子脂质体将表达质粒分别转染SGC7901细胞,48h后荧光显微镜下观察不同浓度质粒的转染效率,通过RT-PCR法检测c-jun和β3GnT8基因mRNA的表达.结果 ①成功构建了四条正确的c-jun siRNA表达质粒;②成功筛选出一条对c-jun有明显抑制作用的siRNA干扰质粒,阻断c-jun表达后,糖基转移酶β3GnT8的表达受到明显抑制.结论 构建的c-jun siRNA表达质粒可以有效抑制胃癌SGC7901细胞株的c-jun基因表达,同时抑制糖基转移酶β3GnT8的表达,为研究胃癌的分子机制提供了一定的理论基础.

人4IgB7-H3对结肠癌细胞SW480中β3GnT8表达的影响

目的探索人结肠癌细胞SW480转染4IgB7-H3后对糖基转移酶133GnT8和细胞表面多聚乳糖胺糖链表达的影响。方法脂质体介导的重组表达载体plRES2-EGFP／4IgB7-H3转染SW480细胞，筛选并获得稳定表达4IgB7-H3的亚克隆细胞株；RT-PCR、WesternBlot检测B3GnT8的表达；流式细胞术检测多聚乳糖胺寡糖链的表达。结果成功获得稳定表达4IgB7-H3的亚克隆细胞株SW480／4IgB7-H3；转染4IgB7-H3的SW480细胞中B3GnT8和多聚乳糖胺糖链的表达均明显下调（P〈0．05）。结论人肠癌细胞中4IgB7-H3过表达能抑制p3GnT8的表达，进而抑制多聚乳糖胺糖链的表达。

GNT型高效烟气脱硫、除尘技术

介绍了采用GNT型高效脱硫除尘器的工程实例。该设备为半干法高效脱硫、除尘一体化设备,脱硫效率达到80%,除尘效率达到90%以上。

β3GnT8基因对HL60细胞体外侵袭能力的影响

目的：初步探讨β3GnT8/GalT7基因对HL60细胞体外侵袭的作用。方法通过脂质体介导将实验室构建好的β3GnT8真核正义表达载体pEGFP-C1-T8-Sense和反义表达载体pEGFP-C1-T8-AntiSense转染入HL60细胞；RT-PCR和Western blot检测浸润转移相关的功能基因TGFβ1、MMP2、MMP14在mRNA水平和蛋白质水平的表达变化；Transwell侵袭实验检测β3GnT8对HL60细胞侵袭转移能力的影响。结果随着β3GnT8表达上调，细胞侵袭能力高于对照组（P＜0.05），MMP2、MMP14在mRNA和蛋白质水平的表达上调，而TGFβ1表达下调；随着β3GnT8表达下调，细胞侵袭能力下降，MMP2、MMP14在mRNA和蛋白质水平的表达下调，而TGFβ1表达上调。结论β3GnT8可在体外增强HL60细胞的侵袭能力，而该作用可能源于它能够诱导肿瘤侵袭相关蛋白的表达变化。

B3GNT6在结直肠癌中的临床特征与生存预后分析

目的回顾性研究β-1,3-N-乙酰氨基葡糖转移酶6(B3GNT6)在结直肠癌患者临床样本中表达的临床意义。方法选取2012年1月至2014年12月中山大学附属第一医院诊治的154例结直肠癌患者的临床病理资料及随访资料。应用免疫组织化学法检测B3GNT6蛋白在肿瘤组织中的表达情况,经过病理玻片扫描仪数字化处理后,借助Qupath软件对阳性区域进行评分,并用X-tile软件选择合适的截断值,应用卡方检验分析B3GNT6蛋白表达差异与临床病理参数的相关性,Kaplan-Meier法分析B3GNT6蛋白表达与患者预后的相关性。结果154例患者年龄(59.8±12.8)岁,男女比例为1.26:1.00。Qupath软件对癌组织进行H-score评分后,X-tile软件计算出H-score最佳截断值为57.44,根据B3GNT6表达情况将所有患者分为B3GNT6低表达组(104例)和高表达组(50例)。B3GNT6低表达与淋巴结转移(P=0.012)、TNM分期(P=0.012)有关。Kaplan-Meier法分析发现B3GNT6高表达组患者预后较好(P=0.0026);单因素及多因素Cox回归分析提示B3GNT6表达是评价结直肠癌患者预后的独立危险因素(HR=0.295,95%CI:0.137~0.634,P=0.002)。结论B3GNT6可能作为结直肠癌患者预后评估的生物标志物。

β3GnT8基因对肺腺癌A549细胞黏附、迁移、侵袭的影响

目的探讨β1,3-N乙酰氨基葡萄糖基转移酶Ⅷ(β3GnT8)基因低表达对肺腺癌A549细胞黏附、迁移、侵袭的影响及作用机制。方法通过脂质体介导将反义表达载体pEGFP-C1-β3GnT8-AntiSense和空载体pEGFP-C1转染入肺腺癌A549细胞;运用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测转染前后β3GnT8 mRNA表达水平,Western印迹检测转染前后其蛋白表达;运用细胞划痕实验检测β3GnT8对A549细胞迁移能力的影响,黏附实验检测β3GnT8对A549细胞黏附能力的影响,Transwell侵袭实验检测β3GnT8对A549细胞侵袭能力的影响;Western印迹检测浸润转移相关的功能基因CD147、基质金属蛋白酶(MMP)-2在蛋白水平的表达。结果A549-AS组β3GnT8 mRNA表达水平显著低于A549组和A549-0组(均P<0.05)。A549-AS组β3GnT8的蛋白表达水平显著低于A549组和A549-0组(均P<0.05)。A549-AS组细胞迁移率显著低于A549组和A549-0组(均P<0.05)。A549-AS组对纤维连接蛋白的黏附百分比及侵袭细胞数目显著低于A549组和A549-0组(均P<0.05)。A549-AS组CD147、MMP-2水平显著低于A549组和A549-0组(均P<0.05)。结论β3GnT8低表达可能通过调控CD147、MMP-2的表达抑制肺腺癌A549细胞黏附、迁移和侵袭。

GNT效应:打造牢固的企业与员工关系

阐述了GNT效应的各种因素,并就正反案例进行了分析,说明激励机制在企业人力资源管理中的重要性。

β3GnT8基因对A549肺腺癌细胞增殖侵袭的影响

目的探讨β1,3-N乙酰氨基葡萄糖基转移酶8(β3GnT8)基因对A549肺腺癌细胞增殖、侵袭的影响。方法将β3GnT8正义真核表达载体(pEGFP-C1-β3GnT8-Sense)和空载体(pEGFP-C1)分别转染A549肺腺癌细胞,分别命名为A549-S组及A549-0组,未转染细胞为A549组。分别采用荧光定量PCR和Western blot检测β3GnT8的mRNA水平表达和蛋白水平的表达;采用MTT法、Transwell侵袭实验分别检测β3GnT8对A549细胞增殖、侵袭能力的影响;Western blot检测浸润转移相关的功能基因基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)在蛋白质水平的表达变化。结果随着β3GnT8表达增高,细胞增殖和侵袭能力均高于A549组,MMP-2、MMP-9在蛋白质水平的表达增高,差异有统计学意义(P<0.05)。A549-0组与A549组差异无统计学意义(P>0.05)。结论β3GnT8高表达可促进A549细胞增殖、侵袭转移。

人源β-N-乙酰葡糖胺转移酶I(hGnT-I)的原核表达与活性鉴定

N-乙酰葡糖胺转移酶I(hGnT-I)功能为在高尔基体中向糖蛋白上的N-寡糖M5GN2结构添加一个β-1,2连接的N-乙酰葡糖胺。为大量获得具有活性的hGnT-I蛋白,构建了重组表达质粒pET28a-MGAT1△TM并将其在大肠杆菌Rosetta菌株中表达。对诱导条件进行优化后,将获得的可溶性重组蛋白His-hGnT-I△TM进行镍柱亲和纯化并通过高效液相色谱(HPLC)检测其体外活性和底物特异性。结果表明,大肠杆菌ROSETTA体系可以成功表达可溶性重组hGnT-I蛋白;该蛋白质相对分子质量约为42800,在体外反应中具有相应的糖基转移酶活性;除天然糖链底物M5GN2外,该蛋白质可以识别非天然糖链底物M3GN2;产物经酶切反应验证,证明该蛋白质催化添加一个β糖苷键连接的N-乙酰葡糖胺的反应。本研究所开发的原核表达体系可以大量制备纯化的功能性重组hGnT-I蛋白,以应用于该蛋白质的性质研究以及N-糖链的体外合成。

基于生物信息学分析B3GNT6作为胃癌早期诊断及预后生物标志物的研究

目的通过生物信息学分析筛选出可以早期诊断及判断胃癌预后的生物标志物。方法从GEO数据库获得GSE数据集,使用GEO2R在线工具筛选出差异表达基因(DEGs),应用基因本体论(GO)及京都基因和基因组数据库(KEGG)进行功能及通路富集分析,利用STRING、Cytoscape和cBioPortal分析出蛋白相互作用(PPI)网络、共表达基因及枢纽(Hub)基因。基于Kaplan-Meier分析预后生存曲线,使用HPA、Onco mine、UALCAN分析Hub基因在胃癌组织中的表达情况。结果本研究共得到26个Hub基因,它们主要富集在O-聚糖(O-glycan)生物过程。Hub基因中生存分析显示B3GNT6和GATA6的GC患者总生存期较差。在TCGA中,B3GNT6在胃癌组织中表达明显下调,而GATA6表达无显著性差异。结论B3GNT6可能作为潜在的胃癌早期诊断及判断预后的生物标志物。

人类β3-N-乙酰氨基葡萄糖基(β3半乳糖)转移酶β3GnT8/GalT7的抗体制备、免疫组化分析及其亚细胞定位

目的探讨β3GnT8(β3GalT7,AY277592,EC2.4.1.-)基因(人类β3-糖基转移酶家族中的一个新成员)的功能。方法原核表达该蛋白,以纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗血清;以Westernblot和免疫组化分析其在多种组织细胞的表达情况;并通过荧光免疫细胞化学进行亚细胞定位。结果获得了较纯的表达蛋白和高效价、高特异性的抗血清,并且发现该蛋白大部分位于核膜周围的胞浆中;免疫组化分析显示肿瘤细胞和组织中该酶有较高的表达,与正常组织比较具有一定的差异性。结论该实验获得了β3GnT8/β3GalT7基因的蛋白质和相应抗体,并且对该蛋白进行了亚细胞定位,为对其生物学功能的进一步研究奠定了基础。

人类β3-糖基转移酶β3GnT8/β3GalT7在恶性血液系统肿瘤细胞中的表达差异及其原核表达和鉴定

目的研究一种新的人类β3-糖基转移酶β3GnT8/β3GalT7在恶性血液系统肿瘤细胞中mRNA水平的表达情况,并在原核体系中克隆和表达。方法运用半定量RT-PCR方法研究人β3GnT8/β3GalT7在13种恶性血液系统肿瘤细胞中的表达谱,以其中表达该基因最高的THP-1细胞的cDNA为模板,克隆目的基因,构建重组表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。经超声裂菌,尿素溶解包涵体,过Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化,透析复性浓缩后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot验证。结果 K562、U937、THP-1和NB4细胞株均较高效表达β3GnT8/β3GalT7,其中THP-1细胞株表达最高;并成功构建原核表达载体pQE30-β3GnT8/β3GalT7,表达出相应的重组蛋白。结论人β3GnT8/β3GalT7在13株细胞中表达有显著差异,并获得大量较纯的目的蛋白,其分子量与预测相符,为单克隆抗体制备及进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。

N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ介导糖尿病小鼠心肌损伤的作用及机制

目的 探究N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ(N-acetylglucosamine transferaseⅤ,GnT-Ⅴ)介导糖尿病小鼠心肌损伤的作用及其机制。方法 6~8周龄雄性C57BL/6小鼠30只,随机分为正常对照组(Ctrl组)、糖尿病组(DM组)和糖尿病+干扰GnT-Ⅴ基因的腺相关病毒组(DM+shGnT-Ⅴ组),每组10只。采用超声心动图检测各组小鼠心功能及左室质量,HE染色观察各组小鼠心肌组织病理变化,实时定量PCR检测心肌组织中心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)和B型钠尿肽(B-type natriuretic peptide, BNP)的表达,免疫印迹方法检测心肌组织中GnT-Ⅴ、转化生长因子-β激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1, TAK1)蛋白表达。体外培养原代心肌细胞,分为正常葡萄糖组(NG组)、高糖组(HG组)、高糖+干扰GnT-Ⅴ基因的腺病毒组(HG+Ad-shGnT-Ⅴ组)和高糖+干扰GnT-Ⅴ基因的腺病毒+过表达TAK1基因的腺病毒组(HG+Ad-shGnT-Ⅴ+Ad-TAK1组)。免疫印迹方法检测原代心肌细胞中GnT-Ⅴ、TAK1蛋白表达,免疫荧光检测α-辅肌动蛋白(α-actinin)表达水平。结果 与Ctrl组相比,DM组小鼠心脏收缩功能显著下降(P<0.001),左室质量明显增加(P<0.001),心肌细胞肥大(P<0.001),GnT-Ⅴ和TAK1表达水平明显升高及ANP和BNP在mRNA水平表达显著增加(P<0.01)。与DM组相比,DM+shGnT-Ⅴ组小鼠心脏功能明显改善(P<0.01),左室质量明显降低(P<0.01),心肌肥大症状明显减轻(P<0.001),GnT-Ⅴ、TAK1、ANP及BNP表达明显减少(P<0.05)。与NG组相比,HG组原代心肌细胞α-actinin免疫荧光强度增强,GnT-Ⅴ和TAK1的表达显著增加(P<0.05);与HG组相比,HG+Ad-shGnT-Ⅴ组GnT-Ⅴ、TAK的表达显著减少(P<0.05),α-actinin免疫荧光强度减弱;与HG+Ad-shGnT-Ⅴ组相比,HG+Ad-shGnT-Ⅴ+Ad-TAK1组GnT-Ⅴ表达未见明显变化,TAK1的表达明显增加(P<0.05),心肌细胞α-actinin免疫荧光强度增强。结论 GnT-Ⅴ可能通过激活TAK1调控糖尿病小鼠的心肌损伤。

人类β3GnT8/β3GalT7对人4IgB7-H3蛋白的翻译后糖基化修饰作用

目的探讨人类β1,3N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶8/β3半乳糖基转移酶7(β3GnT8/β3GalT7)与人4IgB7-H3蛋白的相互作用,以期阐明该糖基转移酶对人4IgB7-H3蛋白的翻译后糖基化修饰作用。方法在线预测软件预测人4IgB7-H3蛋白氨基酸序列上潜在的糖基转移酶作用位点;免疫共沉淀探讨β3GnT8/β3GalT7与人4IgB7-H3蛋白的相互结合作用;细胞免疫荧光化学技术研究两种蛋白质在细胞内的空间定位。结果人4IgB7-H3蛋白氨基酸序列上潜在的N-糖基化位点共有8个,O-β-GlcNAc的附着位置共有18个;β3GnT8/β3GalT7与人4IgB7-H3蛋白能相互结合而被共沉淀;两种蛋白质能在人肺癌A549细胞中共定位。结论人类β3GnT8/β3GalT7可能对人4IgB7-H3蛋白有糖基化修饰作用。