猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5蛋白是病毒主要囊膜结构蛋白和中和抗体主要靶蛋白,广泛应用于PRRS新型疫苗和诊断技术的研究。为获得具有与天然构象相近的PRRSV GP5蛋白,本研究根据草地贪夜蛾(Spdopterafrugiperda)密码子偏好性,优化PRRSV ORF5基因编码密码子,并克隆至杆状病毒载体后转染Sf9昆虫细胞,构建了重组杆状病毒rBac-PRRSV-GP5。经Western blot证实GP5蛋白在Sf9细胞中获得高效表达,且具有良好的免疫反应原性。经镍离子亲和层析纯化后,获得高纯度的重组GP5蛋白,为开展PRRSV诊断技术研发、生物学功能研究等奠定了抗原基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白纳米抗体的筛选及其对病毒复制的抑制效应

为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5蛋白的特异性纳米抗体,并探究其对病毒复制的抑制效应。使用原核表达系统将PRRSV-GP5蛋白大量表达后经镍柱亲和层析法纯化,使用所获的重组GP5蛋白免疫羊驼,并于第0、14、28、42天时采血,检测羊驼体内抗体效价后分离全血淋巴细胞,提取细胞总RNA,反转录后使用巢式PCR扩增出重链抗体可变区(VHH)片段,并与pCANTAB-5E载体相连后转化入TG1感受态细胞,利用噬菌体展示技术构建GP5-VHH噬菌体抗体展示文库。经连续三轮特异性噬菌体的筛选与富集后,淘选出与PRRSV-GP5蛋白高结合力的纳米抗体,通过间接ELISA方法鉴定其反应原性,后将所获的纳米抗体基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,利用Lipofectamine3000转染至Marc^(-1)45细胞内,与PRRSV分别共孵育0、24、36、48、60、72 h,以探究所筛针对PRRSV-GP5蛋白的纳米抗体于胞内对病毒复制与转录产生的影响。结果表明,成功对PRRSV-GP5蛋白进行原核表达并纯化,得到浓度为2.16 mg·mL^(-1)的重组蛋白,对羊驼三次免疫14 d后,其体内抗体效价高达1∶819200,构建GP5-VHH噬菌体抗体展示文库,库容量达2.93×107 CFU·mL^(-1),插入率为98%。经对噬菌体抗体文库连续三轮淘选富集后,最终获得2株不同氨基酸序列的纳米抗体。间接ELISA结果显示,2株纳米抗体均与PRRSV-GP5蛋白具有良好的亲和力。将2株纳米抗体转染至Marc^(-1)45细胞内,它们分别于36与60 h时显著阻碍PRRSV的复制与转录,展现出了较好的阻碍病毒复制的能力。本研究首次筛选出针对PRRSV-GP5蛋白的特异性纳米抗体,且经验证所筛纳米抗体具备抑制PRRSV在细胞内复制的能力,研究结果为抗PRRSV新型药物的研发奠定了试验依据与物质基础。

广西壮族自治区1株类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因的遗传变异分析

[目的]了解广西壮族自治区猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的分子流行病学特征并揭示其遗传变异情况。[方法]利用PRRSV实时荧光RT-PCR试剂盒(通用型)对采集自广西壮族自治区某猪场临床发病猪只的肺脏组织样本进行PRRSV检测;利用PRRSV美洲型经典株与类NADC30 PRRSV毒株双重实时荧光RT-PCR试剂盒对样本进行进一步鉴定;采用PCR法扩增GP5基因,将测序获得的核苷酸序列与GenBank数据库中下载的国内外PRRSV参考株GP5基因核苷酸序列进行同源性比对,并构建系统遗传进化树;对GP5基因推导的氨基酸序列进行比对分析。[结果]经鉴定,该份样本呈类NADC30 PRRSV阳性,命名为GXYL株;GP5基因核苷酸序列同源性分析显示,GXYL株与国内外PRRSV参考株同源性为61.9%~93.2%,与美国NADC30毒株的同源性最高,与欧洲型LV毒株的同源性最低;遗传进化树分析显示,GXYL株与美国NADC30毒株以及中国类NADC30毒株位于同一分支,亲缘关系较近,与其他美洲型毒株同处一个大的分支;GP5基因推导的氨基酸比对分析显示,GXYL株共有7个位点发生变异,其中,2个突变位点位于A表位处,1个突变位点位于B表位处,4个突变位点位于信号肽区域,未发现有氨基酸的插入及缺失。[结论]GXYL株为类NADC30 PRRSV毒株,提示该地区应加强对PRRSV流行及变异情况的监控。

猪繁殖与呼吸综合征病毒HLJ-80株GP5蛋白的生物信息学分析

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是一种严重威胁猪群健康的病毒性疾病。为进一步了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)HLJ-80株GP5蛋白的结构和功能,对该病毒株的GP 5基因进行了生物信息学和序列分析。结果显示,HLJ-80株GP5蛋白编码201个氨基酸,基因全长为603 bp,该蛋白分子质量为22.2 kDa,等电点(pI)为8.85,不稳定系数为39.17。该病毒株GP5蛋白属于疏水性蛋白,含有信号肽,其剪切位点位于第31~32位氨基酸之间。亚细胞定位预测显示GP5蛋白定位于内质网中。根据跨膜螺旋结构的预测,GP5蛋白存在3个跨膜螺旋结构。此外,该蛋白存在38个磷酸化位点和29个O-糖基化位点。抗原性结果显示,GP5蛋白的柔韧性较差,表面可及性区域较少。氨基酸序列同源性结果表明,HLJ-80株与NADC30株的GP5蛋白同源性最高,与GM2株的GP5蛋白同源性最低,且HLJ-80株GP5蛋白存在9个氨基酸突变位点。基因系统结果显示,HLJ-80株与NADC30株GP 5基因具有最近的遗传距离,与QYYZ株GP 5基因具有最远的遗传距离,本研究为监测PRRSV的流行特点提供新的数据。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的结构与功能研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV引起的一种高度接触性传染病。作为一种RNA病毒,PRRSV的基因组存在广泛变异,其中以NSP2和ORF5基因变异为主。由于不同谱系毒株的ORF5有特征性的核苷酸序列,因此ORF5可用于PRRSV的分型。ORF5编码GP5蛋白,GP5蛋白含有多个表位,可与细胞受体作用,从而影响病毒的感染、复制。近年来,关于PRRSV的分子流行病学调查倾向于揭示不同毒株所特有的氨基酸突变。这些突变通常发生在GP5蛋白的信号肽编码区、非中和表位、中和表位和跨膜区。因此有研究将这些突变数据与病毒的毒力强弱、中和能力关联起来。而研究者尝试通过突变来推测GP5蛋白的构象或功能改变,从蛋白互作的结构基础层面来解释这种联系。由于GP5的三级结构并不能用传统的高分辨率冷冻电镜以及X射线晶体学方法观测,因此生物信息学方法成为相关研究的唯一选择。此外,GP5可用于基因工程疫苗的研制。综述了近年来关于GP5蛋白的生物信息学研究,并总结了GP5蛋白对病毒感染、复制、毒力、中和的影响,汇总了基于GP5的基因工程疫苗性能评测。

表达高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的伪狂犬病病毒拯救与纯化

为研制预防高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)感染的重组伪狂犬病病毒(PRV)活载体疫苗候选毒株,本研究依据HP-PRRSV HuN4毒株GP5基因序列设计并合成1对特异引物,BamHⅠ引入到引物的5′端,从HP-PRRSV毒株的RNA中,用RT-PCR扩增HP-PRRSV GP5基因。将BamHⅠ酶切的PCR产物与同样酶切并去磷酸化的PRV转移载体pG相连接,构建重组质粒pG-GP5/HP-EGFP。采用脂质体转染法将pG-GP5/HP-EGFP质粒转染已接种PRV三基因缺失毒株rPRV-gE^(-)/gI^(-)/TK^(-)的ST细胞中,经病毒空斑纯化,获得携有HP-PRRSV GP5基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因的重组伪狂犬病病毒rPRV-GP5/HP-EGFP。将重组病毒rPRV-GP5/HP-EGFP接种CRISPR/Cas9 EGFP敲除质粒转染过的ST细胞,经4轮病毒空斑纯化,最终获得无绿色荧光蛋白的重组病毒rPRV-GP5/HP。经PCR鉴定及测序,证实获得的rPRV-GP5/HP在EGFP基因上缺失了1 232 bp。经RT-PCR和间接免疫荧光试验进一步表明成功构建重组病毒rPRV-GP5/HP。

外周血GP5、APC、GSTP1基因甲基化联合检测与乳腺癌相关性的研究

目的探索外周血GP5、APC、GSTP1基因甲基化联合检测与乳腺癌相关性。方法收集了2020年5月—2020年11月同济大学附属东方医院就诊的172例女性患者,其中有35例乳腺癌患者,90例乳腺良性疾病患者和47例其他组织来源的恶性肿瘤患者。实时荧光定量PCR法测定外周血中GP5、APC、GSTP1的基因甲基化表达水平,并与癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、糖类抗原153(carbohydrate antigen 153,CA153)、糖类抗原125(carbohydrate antigen 125,CA125)及乳腺钼靶进行比较。通过一致性检验和受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析并比较不同检测方法对乳腺癌的评价指标。分析三种基因联合检测的甲基化阳性率与乳腺癌临床病理特征相关性。结果35例乳腺癌患者和90例乳腺良性疾病患者外周血GP5、APC、GSTP1基因甲基化联合检测与组织病理结果的Kappa一致性为0.770。ROC曲线分析外周血基因甲基化联合检测的曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.913(95%CI:0.8490.956),其中灵敏度为88.57%,特异度为92.22%,高于乳腺钼靶(AUC=0.765),高于血清CEA、CA125、CA153联合检测(AUC=0.761)。外周血基因甲基化与3种血清肿瘤指标联合检测的AUC最高为0.949(95%CI:0.8940.980)。35例乳腺癌患者外周血GP5、APC、GSTP1基因甲基化联合检测表达阳性率(88.6%)高于3种血清肿瘤标志物联合检测阳性率(28.6%);术前外周血基因甲基化表达的阳性率与年龄、淋巴结转移、肿瘤分期、肿瘤类型及脉管侵犯均无关(P>0.05)。47例其他组织来源恶性肿瘤与35例乳腺癌患者比较分析结果显示,外周血GP5、APC、GSTP1基因甲基化检测与病理的Kappa一致性为0.849。ROC曲线分析外周血基因甲基化检测的AUC为0.936(95%CI:0.8590.978),灵敏度为88.57%,特异度高达95.74%。结论外周血GP5、APC、GSTP1基因甲基化联合检测具有较高的灵敏度和特异度。外周血GP5、APC、GSTP1基因甲基化有望成为诊断乳腺癌的非侵入性生物标志物。

表达PRRSV NADC30-like毒株GP5-M的重组伪狂犬病病毒的构建及其生物学特性探究

为获得一株能够融合表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5-M蛋白的重组伪狂犬病病毒PRV-GP5-M毒株,以猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)变异株TK基因缺失株PRV FJ01/TK-为病毒载体,以gI/gE基因为插入靶点,利用同源重组技术和CRISPR/Cas9技术敲除gI/gE基因,并在gI/gE位置上插入CMV-GP5-M表达盒,经噬斑纯化,成功构建能够正确表达GP5-M蛋白重组病毒PRV-GP5-M。进一步对该毒株的稳定性、生长动力学、培养特性、安全性等生物学特性进行探究。结果表明,该重组毒株具有良好的遗传稳定性、安全性,易于增殖培养。研究结果为靶向PRRSV GP5与M蛋白生成新的PRRSV疫苗提供了新的线索,同时可为预防近些年流行的PRRSV NADC30-like毒株和PRV变异株的疫苗研发提供重要参考。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白特异性纳米抗体的原核表达及鉴定

为获得针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5蛋白的特异性纳米抗体,并鉴定其抗原结合活性,以本实验室前期获得的PRRSV GP5蛋白特异性纳米抗体VHHGP5基因片段为模板,使用PCR对目的片段进行扩增,将扩增的片段经双酶切处理后连接到pColdSUMO-FLAG载体上,随后转化至E.coli TOP 10感受态细胞。经菌液PCR鉴定,将构建成功的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG作为诱导剂对目的蛋白进行诱导表达,表达产物通过Ni-NTA亲和层析柱纯化。通过SDA-PAGE凝胶电泳分析表达及纯化后的蛋白,同时使用ELISA方法检测纯化后的纳米抗体效价,并使用Western blot鉴定纯化后的蛋白。SDS-PAGE结果显示,成功获得了大小约36 kDa的重组蛋白,利用原核表达系统制备的PRRSV GP5特异性纳米抗体重组蛋白以可溶性形式表达;ELISA结果显示,该纳米抗体结合抗原的效价为1:50000;Western blot结果显示,该纳米抗体具有较好的反应性和特异性。本试验为PRRSV检测用及治疗用新型抗体开发奠定了基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒CHsx1401株GP5蛋白基因的生物信息学分析

为了对猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的结构和功能进行探究,本研究对PRRSV当前流行株CHsx1401的GP5蛋白基因进行生物信息学分析。结果显示,CHsx140株GP5蛋白基因全长603 bp,编码200个氨基酸;分子质量为22 152.89 Da,理论等电点为8.276,不稳定性系数为37.54,属于稳定的疏水性蛋白;信号肽预测显示GP5蛋白在第1~31位氨基酸处存在信号肽;亚细胞定位预测GP5蛋白主要分布于内质网;跨膜螺旋结构预测显示GP5蛋白存在2个跨膜螺旋结构域;且其存在30个O-糖基化位点和39个磷酸化位点;抗原性分析显示GP5蛋白柔韧性差,表面可及性区域少,有多个抗原指数较高区域;GP5蛋白二级结构中以α螺旋为主。氨基酸同源性和序列比对结果显示PRRSV CHsx1401株GP5的氨基酸与NADC30株的同源性最高,与HUN4株同源性最低,且CHsx1401株GP5蛋白存在多个氨基酸突变位点;GP5蛋白基因系统进化分析显示CHsx1401株与NADC30株位于同一个分支,遗传距离最近,与QYYZ株遗传距离最远。本研究对PRRSV CHsx1401株GP5蛋白基因进行生物信息学分析,为进一步研究PRRSV GP5蛋白的结构和功能提供参考。

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰型GP5m蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其在小鼠的免疫反应

猪伪狂犬病毒(PRV)是一种良好的兽用活病毒疫苗载体。但以PRV基因缺失疫苗株TK ^-/gE ^-/LacZ+为载体表达PRRSV GP5的重组病毒TK ^-/gE ^-/GP5+免疫实验动物后难以激发抗PRRSV的中和抗体。为了进一步增强这种重组病毒的免疫效力,本研究用具有更好免疫原性的修饰的ORF5基因(ORF5m)代替天然ORF5基因,构建了表达PRRSV的修饰型GP5m蛋白的重组伪狂犬病毒TK~ ^-/gE~ ^-/GP5m+。经PCR、SouthernBlot、Western blot证实构建正确,并能表达具有活性的GP5m蛋白。将TK ^-/gE ^-/GP5m+与TK ^-/gE ^-/GP5+分别免疫Balb/c小鼠,结果TK ^-/gE ^-/GP5m+免疫小鼠不仅产生了较高水平的抗PRRSV的中和抗体(3/6只达到了1:16),而且在诱导PRRSV特异性细胞免疫方面也显著优于TK ^-/gE ^-/GP5+,表明TK ^-/gE ^-/GP5m+是一种极有希望的PRRSV和PRV二价基因工程候选疫苗。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5羧基端抗原表位的鉴定

为了鉴定和分析猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5羧基端的抗原表位,采用Goldkey软件分析PRRSVGP5羧基端抗原表位,经人工合成的方法获得编码GP5的部分基因,Eag 酶切后插入经Eag 线性化处理的噬菌体M13KEgIII克隆载体,转化至ER2738细胞,得到多株重组噬菌体,提取噬菌体的ssDNA进行PCR及序列鉴定,获得了展示GP5羧基端11个氨基酸的重组噬菌体,用PRRS阳性血清检测重组噬菌体,结果显示噬菌体展示的表位可被PRRSV感染血清所识别,从而证明GP5羧基末端的11个氨基酸是PRRSV的一个抗原表位。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株主要囊膜糖蛋白GP5的遗传变异分析

为了探究高致病性猪蓝耳病病毒(HP-PRRSV)的遗传变异特征,本研究对GenBank中235株HP-PRRSV GP5序列的遗传进化、主要氨基酸基序、抗原性以及N-糖基化位点数量和位置的变异进行了分析。结果表明HP-PRRSV之间的同源性较高,与其他参考毒株相比,这些病毒处于一个相对独立的分支中,而且与经典疫苗株的亲缘关系较远。这有助于解释经典疫苗株对于HP-PRRSV为何起不到理想的免疫保护效果。在病毒的中和表位序列中存在着规律的点突变,同时抗原性比较显示HP-PRRSV与经典毒株之间存在着一定的差异。绝大多数的HP-PRRSV的N-糖基化位点在数量上多一个,而且位置要向羧基端平移2个氨基酸,从而使得中和表位两侧直接与糖链相连,可能会造成中和表位被糖侧链所遮掩,本研究由此推测减弱中和抗体对HP-PRRSV的有效识别,促进病毒逃避机体体液免疫。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白B表位诱导中和抗体能力的研究

为证实GP5蛋白B表位是否具有诱导抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)中和抗体的能力,本实验合成了PRRSV CH-1a株和高致病性PRRSV(HP-PRRSV)HuN4株B表位的短肽,分别免疫家兔制备两份特异性多肽抗血清。此外,将12头PRRSV及其抗体均为阴性的健康仔猪以HP-PRRSV HuN4疫苗毒株(HuN4-F112)进行基础免疫,然后用强毒株(HuN4-F5)进行多次接种,制备猪高免血清。间接免疫荧光检测(IFA)结果显示,两份多肽抗血清均能与PRRSV经典株和变异株发生特异性反应,IFA抗体效价无差异,表明两份血清没有显著差异。病毒中和试验结果表明,两份多肽抗血清均不具有中和PRRSV活性。间接ELISA和病毒中和试验结果表明,猪高免血清中针对B表位肽的ELISA抗体水平与血清抗PRRSV中和抗体之间没有正相关关系,而且B表位肽不能抑制中和抗体。以上结果表明HP-PRRSV B表位不能诱导产生中和抗体。

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5-M在大肠杆菌中的融合表达及其ELISA诊断方法的建立

利用谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)表达系统将猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)的ORF5和ORF6基因依序串联于GST下游 ,并在大肠杆菌中成功表达 ,获得了大小约为 6 0kD的融合蛋白GST GP5 M ,Westernblot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原建立了猪繁殖与呼吸综合征P5 6 ELISA检测方法 ,与国外试剂盒IDEXX ELISA总符合率为 94 1% ,表明建立的P5 6 ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。进一步分析了P5 6 ELISA检测结果与血清中和试验的相关性 ,经回归函数分析 ,发现在临床送检猪血清中的抗融合蛋白GP5 M抗体水平 (OD6 30nm)与中和抗体水平之间的相关性并不高。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M蛋白共表达的自杀性DNA疫苗的构建及其免疫应答

目的探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)自杀性DNA疫苗的免疫效果。方法将ORF5和ORF6基因分别插入可以同时表达两个外源基因的表达载体pSCA2的26S启动子下游,获得ORF5和ORF6双基因共表达自杀性DNA疫苗pSFV-56。结果Westernblot检测证实ORF5和ORF6基因获得正确表达,并且所表达的GP5和M蛋白可以形成异源二聚体。将pSFV-56免疫Balb/c小鼠,首免后4周可检测到特异性PRRSV中和抗体,首免后8周的中和抗体最高可达1﹕32,同时还可检测到较高的特异性细胞免疫应答。进一步将pSFV-56免疫断奶仔猪,二免后4周即可产生1:8～1:16的中和抗体,直到二免后6周仍维持这种高水平的中和抗体,而且也可检测到较高的特异性细胞免疫应答。结论上述研究结果表明pSFV-56具有良好的免疫原性和诱发免疫动物产生较高免疫应答的能力。

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白重组伪狂犬病毒的构建及其生物学特性分析(英文)

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)CH1a株GP5基因插入到伪狂犬病病毒(PseudorabiesVirus,PRV)BarthaK61株TK基因中,获得了一株TK-/gE-表型的重组伪狂犬病病毒,命名为rPRVGP5。经生长动力学、表达动力学和间接免疫荧光证实PRRSVGP5在重组病毒中获得了表达,表达蛋白的抗原性与亲本病毒相似,rPRVGP5在不同的细胞上毒价和细胞病变与BarthaK61比较无显著差异。4只PRV抗体阴性的绵羊,每只接种106.0PFU的rPRVGP5可以完全抵抗103LD50伪狂犬病强毒S株的攻击。10头PRV、PRRSV抗体阴性的仔猪滴鼻接种rPRVGP5107.0PFU/头并在接种后63d攻击PRRSVCH1a株105.0TCID50/头,攻毒后3d和5d出现了PRRSV荧光抗体和ELISA抗体,在攻毒后14d检测到了PRRSV中和抗体,BarthaK61活疫苗组和对照组至实验结束时仍未检测到PRRSV中和抗体。这说明rPRVGP5免疫产生了针对PRRSV的回忆性免疫应答。

表达高致病性猪蓝耳病病毒GP5重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定

将PCR扩增的高致病性猪蓝耳病病毒(HP-PRRSV)HuN4株GP5基因与含绿色荧光蛋白(EGFP)基因的表达盒插入到伪狂犬病毒通用转移载体pgG-uni中,构建了转移载体pgG-HPGP5-EGFP。通过磷酸钙法将转移载体pgG-HPGP5-EGFP和PRV Bartha-K61株的基因组共转染Vero细胞,经过8轮荧光蚀斑筛选和PCR鉴定获得了稳定表达EGFP的重组病毒,命名为rPRV-HPGP5。IFA和western blot结果证实HP-PRRSV HuN4株GP5在重组病毒中得到了有效表达。该重组病毒的获得为高致病性猪蓝耳病基因工程疫苗的研究奠定了基础。

猪IL-15与PRRS病毒GP5基因核酸疫苗免疫效力

通过分子克隆技术构建了表达猪白细胞介素(IL)-15及猪繁殖呼吸综合症(PRRSV)病毒GP5基因重组核酸疫苗。以小鼠为试验模型,利用猪IL-15作为分子佐剂并检测其对表达PRRS病毒GP5基因核酸疫苗的免疫增强作用。结果表明,猪IL-15与GP5试验组小鼠抗体水平和T淋巴细胞亚群数量均高于PBS对照组及GP5基因单独免疫组,表明猪IL-15对核酸疫苗可有效增强PRRS病毒GP5基因的免疫效果,证实了其佐剂效应。

PRRSV GP5蛋白和CSFV E2蛋白在杆状病毒囊膜表面的共展示及展示蛋白的免疫原性分析

本试验旨在构建以杆状病毒表面展示系统为基础的猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟双价基因工程亚单位疫苗候选株。利用杆状病毒表面展示技术构建展示猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白和猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的重组杆状病毒BacSC-Dual-ORF5-E2。该重组病毒带有His6标签,且胞质区域(CTD)和跨膜区域(TM)均来源于杆状病毒囊膜蛋白gp64的CTD和TM。对重组病毒进行Western blot分析、激光共聚焦显微镜观察、免疫金电子显微镜检测、动物免疫试验以及淋巴细胞增殖试验。Western blot分析结果表明,重组杆状病毒中表达了重组GP5和E2蛋白;激光共聚焦显微镜检测表明,重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf-9后在细胞膜上展示了重组GP5和E2蛋白;免疫金电子显微镜观察表明,重组GP5和E2蛋白展示在杆状病毒囊膜上;动物免疫试验表明,重组杆状病毒免疫小鼠后产生了抗PRRSV和抗CSFV的特异性抗体;淋巴细胞增殖试验表明,重组杆状病毒能诱发较强的细胞免疫应答。本试验成功构建表面展示PRRSV GP5蛋白和CSFV E2蛋白的重组杆状病毒,为下一步应用该重组杆状病毒作为双价亚单位疫苗预防PRRSV和CSFV的混合感染奠定基础。