gpd1基因莱茵衣藻表达载体构建及农杆菌介导转化莱茵衣藻

甘油3-磷酸酰基转移酶基因(gpd1)可以调控植物脂质代谢中关键酶甘油-3-磷酸脱氢酶(GPDH)的活性,能促进植物脂质合成。本研究以莱茵衣藻FACHB-479为受体,通过克隆酵母gpd1基因,构建莱茵衣藻的农杆菌双元表达载体pRI-Ble-GPD1,首次以农杆菌介导法将携带在农杆菌LBA4404的gpd1基因转移到FACHB-479基因组。在含有10μg/m L博莱霉素的TAP平板筛选得到抗性藻体细胞。经过分子生物学PCR及RTPCR鉴定,获得转基因藻FACHB-GPD。尼罗红染色法鉴定分析FACHB-GPD细胞中油脂含量增高1.3~1.52倍。该研究表明农杆菌介导外源gpd1基因在莱茵衣藻FACHB-479基因组的过表达能增加脂肪酸含量,从而提高其产油能力。

种子特异启动子的GPD1基因植物表达载体构建

利用PCR技术从甘蓝型油菜(Brassica napus L.)和酵母INVSc1(Saccharomyces cerevisiae)的基因组DNA中分别扩增获得种子特异启动子napin和3-磷酸甘油脱氢酶(GPD1)基因片段,并将它们分别克隆到pMD18-T载体中。利用中间载体pBluescriptKS将两目的片段插入到植物表达载体pCAMBIA1390的多克隆位点处,构建了种子特异启动子napin驱动的GPD1基因植物表达载体p1390NG,并用冻融法将其导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404、EHA105和AGL1中,可应用于油料能源植物种子含油量的遗传改良。

转lpaat和gpd1基因工程藻的快速筛选

根据莱茵衣藻密码子偏好性对源于油菜的溶血磷脂酸酰基转移酶基因(lpaat)和酵母的甘油3-磷酸酰基转移酶基因(gpd1)进行优化,获得适合莱茵衣藻表达的c-lpaat和c-gpd1基因,将其连接到p H124质粒中,构建相应的衣藻表达载体.通过珠磨法进行遗传转化,经Zeomycin抗性筛选和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)验证,获得导入c-lpaat和c-gpd1的转基因藻.利用半定量反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)技术筛选高效表达c-lpaat和c-gpd1的转基因藻,目的基因的转录水平分别提高了56.38%和75.95%,其藻细胞的脂肪酸含量也得到相应增加,与基因表达情况一致.证明莱茵衣藻可以有效表达外源高等植物的基因,利用半定量RT-PCR可以快速筛选出潜在的高油脂含量转基因工程藻株.

过量表达鲁氏酵母耐盐基因GPD1对酿酒酵母的影响

GPD1是3–磷酸甘油脱氢酶的编码基因,在酵母的耐盐通路中发挥着重要的作用.为了探讨耐盐酵母家族成员鲁氏酵母的GPD1对酿酒酵母的影响,本文利用分子生物学方法构建了质粒YEplac195-GPD1,并将其转入到酿酒酵母菌株W303中,得到工程菌株WYS.研究发现在菌株WYS中过量表达鲁氏酵母的GPD1,其耐盐性、抗性及甘油产量均明显高于对照菌株WY,特别是在含盐量为18%的情况下菌株WYS甘油产量提高了14.35%.说明GPD1的过量表达是菌株耐盐性提高的重要原因.

新抑癌基因GPD1在结肠癌细胞HCT-8中的作用及其预后潜力研究

目的探究新抑癌基因甘油-3-磷酸脱氢酶1(glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1,GPD1)在结肠癌发生、发展中的作用及其与临床预后的关系。方法应用HCT-8结肠癌细胞系,以siRNA干扰GPD1表达后进行细胞功能实验,分别以MTS实验与集落形成实验检测细胞增生活力与集落形成能力,以划痕试验、Transwell实验探究GPD1对HCT-8细胞系迁移能力的影响。对TCGA数据库进行生物信息学分析,探究GPD1表达水平与结直肠癌患者临床预后的关系,并明确GPD1低表达与其编码基因甲基化之间的关系。结果干扰GPD1基因表达后,HCT-8细胞增生活力明显增强,重复实验差异具有统计学意义(P<0.01);集落形成实验结果显示,GPD1干扰后的HCT-8细胞集落数目增多且集落直径增大,差异具有统计学意义(P<0.01)。划痕实验与Transwell实验结果显示,敲低GPD1表达的HCT-8细胞迁移能力无显著变化,表明GPD1对结肠癌细胞迁移能力无影响。生物信息学分析结果显示,GPD1低表达的结直肠癌患者总存活率(χ^2=4.1,P=0.040)及无病存活率(χ^2=13.2,P<0.000 1)均明显低于GPD1高表达患者,且GPD1低表达水平是结直肠癌预后不良的独立风险因素(P<0.05)。甲基化分析结果显示,结直肠癌组织中GPD1低表达与其编码基因高甲基化呈负相关(P<0.05)。结论 GPD1在结肠癌中发挥抑制细胞增生与集落形成的作用,且GPD1低表达是结直肠癌患者不良预后的独立预测因素。

miR-539靶向GPD1L对雨蛙素诱导的急性胰腺炎细胞模型凋亡和自噬的影响

目的研究miR-539对雨蛙素(Cerulein)诱导的急性胰腺炎(AP)细胞模型凋亡和自噬的影响及分子机制。方法用15 nmol/L Cerulein处理胰腺腺泡A42J细胞4、8、12、24 h,建立AP模型。淀粉酶试剂盒检测细胞上清中淀粉酶(AMY)水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养上清中白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平,实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-539和甘油3-磷酸脱氢酶1样蛋白(GPD1L)mRNA的水平,Western印迹检测GPD1L、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、膜型LC3(LC3Ⅰ)、胞浆型LC3(LC3Ⅱ)、Beclin1和p62的表达,流式细胞术测定细胞凋亡率,双荧光素酶报告系统验证miR-539与GPD1L间的调控关系。结果与Control组相比,Cerulein组AR42J细胞中miR-539含量显著升高(P<0.05),GPD1L mRNA和GPD1L蛋白含量显著降低(P<0.05),与Control组相比,Cerulein组AR42J细胞中miR-539含量和细胞凋亡率Bax、LC3-ⅡCerulein均显著升高,Bcl-2、p62含量显著降低(P<0.05);与Cerulein+anti-miR-con组相比,Cerulein+anti-miR-539组结果相反(P<0.05)。与miR-con组相比,过表达miR-539的Cerulein处理组细胞中GPD1L mRNA和蛋白含量均显著降低(P<0.05);抑制miR-539组的Cerulein处理组细胞中GPD1LmRNA和蛋白含量均显著升高(P<0.05)。与Cerulein+pcDNA-NC组相比,Cerulein+GPD1L组的AR42J细胞中GPD1L Bcl-2、p62水平显著升高(P<0.05),细胞凋亡率、Bax、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和Beclin1含量均显著降低(P<0.05)。与Cerulein+anti-miR-539+si-con组相比,Cerulein+anti-miR-539+si-GPD1L组AR42J细胞中GPD1L、Bcl-2、p62、细胞凋亡率均显著下降,LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和Beclin1、Bax显著升高(P<0.05)。结论miR-539通过靶向GPD1L调控Cerulein诱导的胰腺AR42J细胞凋亡和自噬。

GPD1过表达调控葡萄酒酵母酒精和风味物质的生成量

本研究以葡萄酒酵母WY1为出发菌株,探究GPD1基因过表达对葡萄酒酵母菌产酒精能力及风味物质的影响。利用分子生物学技术,采用PCR技术扩增葡萄酒酵母WY1中甘油-3磷酸脱氢酶基因GPD1,构建了单拷贝GPD1,两拷贝GPD1和三拷贝GPD1重组菌株。利用Real-TimePCR技术对GPD1基因表达量进行检测,与出发菌株WY1相比,单拷贝GPD1,两拷贝GPD1和三拷贝GPD1重组菌株中GPD1基因的表达水平分别提高了1.75倍、3.02倍和3.42倍。葡萄酒发酵实验数据显示,GPD1基因的过表达对乙醇的降低有显著效果,单拷贝GPD1,两拷贝GPD1和三拷贝GPD1重组菌株分别比WY1降低了8.07%,14.36%和15.34%;总高级醇含量分别减少了15.20%、17.11%和16.55%;乙酸乙酯的含量分别下降了17.63%、23.81%和27.42%,乙酸异戊酯含量分别下降了11.78%、15.87%、17.79%;甘油生成量分别提高了1.02倍、1.80倍和1.83倍。本研究表明过表达GPD1基因可以影响葡萄酒酵母产酒精的能力,同时对改善葡萄酒风味有重要意义。

酵母菌3-磷酸甘油脱氢酶基因(gpd1)的克隆及其在高渗胁迫下mRNA转录水平的差异

YY、FHS和WFB是生产中常用的酵母菌株。在高渗胁迫下的生长速度依次为FHS、YY、WFB。克隆gpd1基因片段并测序,再与NCBI公布的gpd1序列(X76859)比较,WFB、YY、FHS的同源性分别为99·32%、99·83%、99·83%,YY、FHS菌株的gpd1序列与NCBI上的gpd1序列(X76859)对应的氨基酸序列完全一致,WFB与它们的同源性只有98·5%。用不同浓度的NaCl培养酵母细胞进行渗透胁迫处理,RNA点杂交显示YY、FHS菌株gpd1基因的mRNA表达量在NaCl浓度上升时候有上升的趋势;WFB菌株gpd1基因的mRNA表达量随NaCl浓度的上升逐渐降低。实验结果显示,gpd1基因mRNA转录水平与抗高渗能力相关。

沙棘GPD1和DGAT1双基因载体的构建及表达验证

为了提高沙棘种子的品质,选取大连民族大学校园内的沙棘‘实优1号’的种子为研究对象,用野生型拟南芥(Col-0)作为目的基因的转化受体,以沙棘种子油脂合成关键基因GPD1和DGAT1为载体,通过In-fusion连接技术构建HrGPD1和HrDGAT1基因双价表达载体pCGD,采用农杆菌蘸花法获取转基因拟南芥植株,利用甲酯化和氯仿甲醇法对和野生型的拟南芥植株种子进行脂肪酸不同组份的比例及含油率检测。结果表明:拟南芥转基因2代与野生型相比,拟南芥2代种子油酸、亚油酸的比例分别提高了46.70%和9.35%,但种子含油率未明显提高。因此,同时表达沙棘HrGPD1和HrDGAT1基因提高了油酸、亚油酸含量,为高油酸沙棘优良品种的培育和改良提供了基因材料。

PScgpd1启动子融合GUS基因在酿酒酵母中的瞬时表达

利用PCR技术从酿酒酵母基因组克隆得到甘油代谢关键酶基因gpd1启动子,并成功构建真核生物穿梭表达载体pYX212-zoecin-PScgpd1-GUS,并将其电击转入酿酒酵母中。将构建成功的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae基因工程菌分别在0.2,0.5,1.0 mol/L NaCl的盐胁迫下培养,首次通过GUS组织化学染色法和荧光法测定GUS报告基因的瞬时表达酶活检测gpd1启动子的酶活表达。研究发现,酵母甘油代谢关键酶基因gpd1启动子在不同渗透压下的表达有明显的差异。证实了gpd1启动子是受渗透压调节的,属于诱导型启动子,这可能与渗透压胁迫下的甘油代谢密切关联,相关研究未见报道。

酿酒酵母gpd1和hor2基因在大肠杆菌中的共表达

利用途径工程的方法,在大肠杆菌中构建一条新的产甘油的代谢途径。从酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)克隆3_磷酸甘油脱氢酶基因(gpd1)和3_磷酸甘油酯酶基因(hor2 ) ,并将两个基因串连到启动子trc的下游,构建由trc启动子控制的能高效表达的多顺反子重组质粒pSE_gpd1_hor2 ,将重组质粒导入大肠杆菌BL2 1菌株中,构建得到的重组菌株GxB_gh能将葡萄糖转化为甘油。结果表明重组菌株GxB_gh以葡萄糖为底物进行发酵,甘油产量为4 6 6 7g L ,葡萄糖的转化率为4 2 87%。这为利用工程菌绿色生产甘油进行了前期的探索,也为进一步构建能生产1,3_丙二醇的工程菌打下了良好的基础。

重度子痫前期胎盘组织中miR-210及GPD1L的相关性分析

目的分析miR-210及GPD1L在重度子痫前期胎盘组织中的表达及其相关性。方法选取2018年1月-2018年12月在笔者所在医院住院并行剖宫产分娩的40例重度子痫前期孕妇为试验组及40例产前检查正常并行剖宫产分娩的健康孕妇为对照组。采用免疫组织化学法检测两组胎盘组织中HIF-1α蛋白及GPD1L蛋白的表达情况。采用real-time PCR(RT-PCR)法分别检测两组胎盘组织中miR-210、GPD1L mRNA及HIF-1αmRNA的含量。结果 (1)与对照组相比,重度子痫前期组胎盘组织GPD1L蛋白的表达水平明显降低,其阳性表达率为(32.5%,P<0.05);HIF-1α蛋白的表达水平明显升高,其阳性表达率为(65%,P<0.05);重度子痫前期胎盘组织中miR-210的表达水平较高(10.010±3.153,t=6.942,P<0.001),GPD1LmRNA的表达水平较低(0.440±0.264,t=-5.013,P<0.001);HIF-1αmRNA的表达水平较高(7.331±2.407,t=6.397,P<0.001)。(2)在重度子痫前期胎盘组织中,miR-210的表达水平与GPD1L mRNA的表达水平存在明显的负相关(r=-0.911,P<0.001)。结论 miR-210可能通过抑制GPD1L mRNA的表达上调HIF-1α蛋白的含量而参与重度子痫前期的病理生理过程。

GPD1酶在毕赤酵母中的表达及纯化

目的构建可以分泌表达GPD1酶的毕赤酵母,并使用Profinia蛋白纯化系统获得纯度90%以上的GPD1酶,扩大GPD1酶的制备,以进一步研究其在肿瘤中的功能及作为抗肿瘤靶点的临床应用研究。方法提取人细胞的总RNA,逆转录成cDNA,以此为模板通过PCR扩增GPD1基因,PCR产物与表达载体pPICZα-C用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,连接构建重组表达质粒pPICZα-C-gpd1;pPICZα-C-gpd1质粒电转至毕赤酵母X-33中,筛选阳性转化子,经甲醇诱导表达,采用固化金属亲和层析(IMAC)纯化分泌的目的蛋白。结果经SDS-PAGE鉴定,成功表达和纯化了GPD1酶,纯度达90%以上。结论本研究建立了毕赤酵母分泌表达GPD1酶的方法,可用于制备GPD1酶,为进一步的肿瘤机制研究和应用研究奠定基础。

柑橘溃疡病菌gpd1基因在致病性中的功能分析

甘油作为微生物重要的能量来源及抗逆因子,对其生存具有重要作用。gpd1基因编码甘油-3-磷酸脱氢酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase,G3PDH),是甘油合成代谢途径中关键的限速酶。本研究分析了gpd1基因在柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)致病性中的功能。对Xcc强毒菌株Xcc021和弱毒菌株Xcc049E分别进行了gpd1的缺失突变,发现gpd1缺失仅影响强毒菌株Xcc021在感病柑橘寄主上的毒性以及gpd1缺失影响Xcc在营养贫乏培养基中的生长能力,功能互补子能够恢复毒性和生长能力至野生型水平。其他毒性相关表型显示:与野生型Xcc021相比,gpd1突变体菌体的沉降能力增加,游动性降低,生物膜形成能力增强,功能互补子能够恢复这些表型至野生型水平。这表明gpd1基因在强毒菌株中是重要的毒性因子,其涉及的甘油代谢途径可能在强弱毒菌株对于寄主柑橘的毒性具有不同的作用。

人类3-磷酸甘油脱氢酶1基因第三外显子的单核苷酸多态性研究

通过基因组克隆和测序技术,研究人类3-磷酸甘油脱氢酶基因(glycerol 3-phosphatedehydrogenase 1,简称GPD1)第三外显子的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,简称SNP)情况.发现成都地区人类GPD1的第三外显子上存在4个SNP位点,分别为G69A,G81A,A121C和A127T,其中G81A和A121C为已经报道过的SNP,G69A和A127T为新发现的SNP.在这些SNP中,A121C和A127T会引起氨基酸的改变,分别为Thr113Pro和Ile115Leu.通过分子建模的方法分析这两个错义突变对GPD1蛋白分子结构的影响,发现113位氨基酸残基的替换为极性氨基酸苏氨酸和非极性氨基酸脯氨酸之间的转换,而且113位氨基酸残基暴露于蛋白分子表面,所以该突变可能会对蛋白分子的性质和功能造成一定的影响.

3-磷酸甘油脱氢酶1基因突变致婴儿期短暂性高甘油三酯血症1例

1例随访1年余的3-磷酸甘油脱氢酶(GPD1)基因突变致婴儿期短暂性高甘油三酯血症(HTGTI)患儿并复习文献,发现HTGTI婴儿期起病为主,临床以肝大、脂肪肝、高脂血症、轻度转氨酶异常为特征。且有长期甚至延续至成年的肝脏脂肪代谢异常、肝酶升高以及生长发育问题,故长期干预及远期预后值得临床医生关注。