三种融合标签对大熊猫轮状病毒结构蛋白VP6-VP7可溶性表达的影响

大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus,GPRV)是引起幼龄大熊猫腹泻的主要病原,对圈养大熊猫产生了较大的危害。轮状病毒结构蛋白VP6是一种载体蛋白,可介导黏膜免疫反应。VP7是轮状病毒结构蛋白中主要的中和抗原。因此,VP6-VP7的融合表达作为候选抗原对该病的防治具有重要的意义。传统大肠埃希菌原核表达存在表达量低、可溶性差以及纯度低等弊端。本研究使用醛缩酶(EDA)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)3种融合标签,以实现获得表达量高和纯度高的GPRV-VP6-VP7重组表达蛋白。将扩增的 VP 6、 VP 7基因片段利用同源重组酶构建到含3种融合标签的表达载体pET21b上,将重组质粒转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)感受态细胞中进行低温诱导表达。用Ni-柱亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Image J分析蛋白表达量和可溶性,Western blot分析得到表达的重组表达蛋白正确且具有蛋白活性。实验结果证明,EDA标签能显著促进VP6-VP7蛋白的原核可溶性表达,提高VP6-VP7蛋白表达量。

大熊猫轮状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了能对大熊猫轮状病毒的早期感染和隐性感染做出有效诊断,并为病毒定量分析提供技术支持。本研究根据Gen Bank中登录的大熊猫轮状病毒(GPRV)VP4基因序列设计1对引物,建立一种快速准确的检测大熊猫轮状病毒的荧光定量RT-PCR方法,并对引物浓度、退火温度和循环数进行优化,同时建立标准曲线,并将建立的荧光定量方法与常规RT-PCR方法比较。结果显示,本试验建立的荧光定量RT-PCR方法灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,比常规RT-PCR灵敏度高出至少100倍。特异性和重复性检测结果表明,该方法具有良好的特异性和较高的重复性。研究结果表明该方法可以对大熊猫轮状病毒进行稳定、可靠的检测,可以满足大熊猫轮状病毒特性研究和感染诊断的需要。

人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体的生物学鉴定及其小鼠体内中和活性测定

目的对从噬菌体抗体库中筛选的人源抗狂犬病毒单链抗体A12进行生物学活性鉴定及小鼠体内中和活性检测。方法用免疫荧光法检测其结合感染狂犬病毒CVS的鼠脑组织的能力,用小鼠中和实验测定A12表达产物的体内中和活性。结果免疫荧光试验显示A12表达产物与感染CVS的鼠脑细胞有强的荧光反应。小鼠中和试验结果表明,A12ScFv样品组小鼠有9只存活,而对照组小鼠全部死亡。A12在729倍稀释时能100%保护小鼠抵抗致死量狂犬病毒的脑内攻击。结论A12对狂犬病毒具有一定的中和活性,有可能被用于暴露后狂犬病的预防。