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GST Pull-down实验鉴定NF-κB相互作用多肽 被引量:5
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作者 李生茂 梁华平 +1 位作者 徐祥 刘东擘 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期94-97,共4页
目的体外鉴定NF-κB相互作用多肽与p50和p65间的相互作用。方法首先构建GST-作用多肽融合蛋白的原核表达载体pET-42a/polypeptide及NF-κB p50和p65亚基保守结构域的原核表达载体pET22b/p50和pET22b/p65,并在大肠杆菌E.coliBL-21中诱导... 目的体外鉴定NF-κB相互作用多肽与p50和p65间的相互作用。方法首先构建GST-作用多肽融合蛋白的原核表达载体pET-42a/polypeptide及NF-κB p50和p65亚基保守结构域的原核表达载体pET22b/p50和pET22b/p65,并在大肠杆菌E.coliBL-21中诱导表达,后进行GST pull-down实验验证多肽与NF-κB p50和p65的结合效应。结果经诱导表达获得了可溶性的GST-多肽融合蛋白和具有DNA结合活性的p50p、65蛋白,GST pull-down实验证实3条多肽与p50发生特异地相互作用。结论证实3条多肽在体外能与p50发生物理性的相互作用,这为获得靶向NF-κB的功能拮抗多肽工作奠定了基础。 展开更多
关键词 gst pull—down实验 多肽 NF—κB p50/p65 蛋白间相互作用
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GST pull-down技术验证CIPK7蛋白激酶与CBL1蛋白的相互作用 被引量:3
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作者 黄聪琳 丁硕 +1 位作者 姜华 安黎哲 《兰州大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期828-832,共5页
采用DNA重组技术,构建pGEX-4T-3-CIPK7和pET28-CBL1蛋白表达载体,转化大肠杆菌并诱导表达目的蛋白,利用亲和层析纯化法纯化GST标签、His标签融合蛋白,通过GST pull-down试验验证CIPK7与CBL1之间的相互作用.成功构建了CBL1和CIPK7的重组... 采用DNA重组技术,构建pGEX-4T-3-CIPK7和pET28-CBL1蛋白表达载体,转化大肠杆菌并诱导表达目的蛋白,利用亲和层析纯化法纯化GST标签、His标签融合蛋白,通过GST pull-down试验验证CIPK7与CBL1之间的相互作用.成功构建了CBL1和CIPK7的重组质粒,经诱导表达及纯化获得了可溶性GSTCIPK7和CBL1-His融合蛋白,GST pull-down试验证实了CBL1能够与CIPK7结合.CIPK7蛋白与CBL1蛋白之间存在直接的相互作用,为进一步研究蛋白激酶CIPK7的功能奠定了基础. 展开更多
关键词 CBL1蛋白 gst pull-down CIPK7蛋白 蛋白质相互作用
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GST pull-down验证流感病毒PB1-F2蛋白与热休克蛋白40的相互作用 被引量:2
3
作者 侯佩莉 关振宏 +2 位作者 张茂林 李影 段铭 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期202-207,共6页
为体外验证流感病毒PB1-F2与热休克蛋白Hsp40相互作用,通过两个方向的GST pull-down试验验证PB1-F2与Hsp40的相互作用。构建GST-多肽融合蛋白原核表达载体pGEX-6P-1-PB1-F2和pGEX-6P-1-Hsp40,并在大肠杆菌(E.co-li)BL21中诱导表达;构建... 为体外验证流感病毒PB1-F2与热休克蛋白Hsp40相互作用,通过两个方向的GST pull-down试验验证PB1-F2与Hsp40的相互作用。构建GST-多肽融合蛋白原核表达载体pGEX-6P-1-PB1-F2和pGEX-6P-1-Hsp40,并在大肠杆菌(E.co-li)BL21中诱导表达;构建真核表达载体pLEGFP-Hsp40及pCAGGS-PB1-F2,并分别转染293T细胞使其表达Hsp40及PB1-F2融合蛋白,然后进行GST pull-down试验验证二者的相互作用。成功地构建了两种蛋白的各种表达载体,经表达、纯化获得了可溶性的GST-多肽融合蛋白,GST pull-down试验正反两方向都证实了PB1-F2与Hsp40的相互作用,初步证实了流感病毒PB1-F2在体外能与Hsp40发生相互作用。 展开更多
关键词 gst pull-down 流感病毒PB1-F2蛋白 热休克蛋白40 蛋白质相互作用
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GST pull-down验证新城疫病毒基质蛋白与鸡importinβ1蛋白的相互作用 被引量:1
4
作者 胡焱 段志强 +4 位作者 嵇辛勤 赵佳福 邓珊珊 李世静 熊建民 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期126-133,共8页
旨在利用GST pull-down技术验证新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基质(matrix,M)蛋白与鸡importinβ1蛋白在体外的相互作用。根据NDV ZJ1株M基因和鸡importinβ1基因序列设计引物,通过PCR扩增获得NDV M基因和鸡importinβ1基因... 旨在利用GST pull-down技术验证新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基质(matrix,M)蛋白与鸡importinβ1蛋白在体外的相互作用。根据NDV ZJ1株M基因和鸡importinβ1基因序列设计引物,通过PCR扩增获得NDV M基因和鸡importinβ1基因,将其分别定向插入到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a(+)构建重组原核表达载体pGEX-6p-M、pET-32a-importinβ1,然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导表达,SDSPAGE检测重组蛋白的表达情况,并对包涵体重组蛋白进行变性和复性处理。然后以GST-M重组蛋白为诱饵蛋白,His-importinβ1重组蛋白为猎物蛋白,利用GST pull-down技术验证M蛋白与importinβ1蛋白的相互作用。结果表明,成功构建了重组原核表达载体pGEX-6p-M和pET-32a-importinβ1,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)获得了正确表达。SDS-PAGE电泳检测显示GST-M重组蛋白主要以包涵体形式存在,而His-importinβ1重组蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在。利用蛋白重折叠试剂盒获得了有活性的GST-M重组蛋白,将其作为诱饵蛋白,可以捕获并检测到His-importinβ1重组蛋白,但是GST标签蛋白不能结合His-importinβ1重组蛋白。利用GST pull-down技术证实了NDV M蛋白与鸡importinβ1蛋白在体外具有直接的相互作用,这为深入研究importinβ1蛋白在NDV M蛋白细胞核定位的分子机制以及在NDV复制和致病中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 新城疫病毒 基质蛋白 importinβ1蛋白 gstpull-down 蛋白相互作用
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基于GST-pull down的小G蛋白Rac1活性检测体系的建立 被引量:1
5
作者 甄诚 陈亮 +2 位作者 柏兆方 王芊艺 满江红 《生物技术通讯》 CAS 2011年第4期540-543,共4页
目的:根据人PAK1基因的p21结合结构域(PBD)能够特异结合GTP-Rac1的特性,构建GST-PBD原核表达质粒,并利用GST-pull down方法检测真核细胞内小G蛋白Rac1的活性。方法:将人PAK1基因的PBD结构域克隆到pGEX原核表达载体上,经诱导纯化得到GST-... 目的:根据人PAK1基因的p21结合结构域(PBD)能够特异结合GTP-Rac1的特性,构建GST-PBD原核表达质粒,并利用GST-pull down方法检测真核细胞内小G蛋白Rac1的活性。方法:将人PAK1基因的PBD结构域克隆到pGEX原核表达载体上,经诱导纯化得到GST-PBD融合蛋白,并通过GST-pull down实验评估该方法的特异性和准确性。结果:pGEX-PBD质粒构建成功;纯化得到的GST-PBD融合蛋白能够特异性地与激活形式的Rac1(GTP-Rac1)结合,并且能够准确反映血小板衍生生长因子刺激下细胞内Rac1的激活过程。结论:GST-PBD融合蛋白及其整套GST-pull down检测体系能方便有效地检测细胞内Rac1的活性。 展开更多
关键词 RAC1 小G蛋白 gst-pulldown
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GST pull-down联合LC-MS/MS筛选柑橘抗溃疡病转录因子CsBZIP40的互作蛋白 被引量:4
6
作者 窦万福 祁静静 +7 位作者 胡安华 陈善春 彭爱红 许兰珍 雷天刚 姚利晓 何永睿 李强 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第13期2243-2255,共13页
【目的】CsBZIP40是一个与溃疡病抗性相关的转录因子,本研究旨在筛选转录因子CsBZIP40在响应柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)侵染过程中的互作蛋白,对CsBZIP40的互作网络进行分析,为柑橘抗溃疡病的分子育种提供理论... 【目的】CsBZIP40是一个与溃疡病抗性相关的转录因子,本研究旨在筛选转录因子CsBZIP40在响应柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)侵染过程中的互作蛋白,对CsBZIP40的互作网络进行分析,为柑橘抗溃疡病的分子育种提供理论依据。【方法】采用GST pull-down技术筛选柑橘在溃疡病菌侵染过程中CsBZIP40的互作蛋白。首先,构建带有GST标签的CsBZIP40蛋白融合表达载体,经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达、纯化后获得GST-CsBZIP40融合蛋白作为诱饵蛋白;然后,将GST-CsBZIP40融合蛋白固定在谷胱甘肽亲和磁珠上,用固定在亲和磁珠的GST-CsBZIP40诱饵蛋白与接种溃疡病菌或LB培养基后柑橘叶片总蛋白进行孵育,与GST-CsBZIP40诱饵蛋白结合的蛋白复合物洗脱收集后进行SDS-PAGE凝胶电泳验证。将验证成功的样品洗脱液进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测,鉴定出未侵染和侵染状态下CsBZIP40的互作蛋白,将检测到的蛋白利用甜橙基因组数据库进行注释,筛选出在溃疡病菌侵染过程中与CsBZIP40特异结合的蛋白,并进行GO、KEGG和互作网络分析。【结果】过表达CsBZIP40的转基因植株表型正常,与对照植株无明显差异。过表达CsBZIP40的转基因植株溃疡病抗性评价中病斑面积、病情指数均显著小于野生型植株,分别为野生型的45%和54%。以该转基因植株为材料成功提取出侵染溃疡病菌后和未接种溃疡病菌状态下的柑橘叶片总蛋白。成功构建出GST-CsBZIP40诱饵蛋白表达载体,诱导表达纯化出GST-BZIP40诱饵蛋白。利用GST-CsBZIP40诱饵蛋白从侵染溃疡病菌后柑橘总蛋白和未接菌柑橘总蛋白中成功钓取蛋白,并用LC-MS/MS检测。经过比对、注释和筛选,在柑橘溃疡病菌侵染过程中与GST-BZIP40特异结合的蛋白有53个,这些蛋白参与多个分子功能和通路。在这53个蛋白中,有6个蛋白(Cs1g02310、Cs3g05280、Cs3g23950、Cs6g13880、Cs7g12130、orange1.1t04973)可能与植物抗病性密切相关。数据库中已经证明53个蛋白中44个与CsBZIP40有直接或间接的互作关系。【结论】溃疡病菌侵染过程中有53个蛋白与CsBZIP40互作,根据注释6个蛋白与植物抗病性密切相关,这些蛋白可能在提高柑橘生物胁迫抗逆性方面发挥着重要的作用。 展开更多
关键词 柑橘 柑橘溃疡病 柑橘溃疡病菌 BZIP gst pull-down 互作蛋白
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GST-pull down技术筛选毛白杨天冬氨酸蛋白酶PtoAED3互作蛋白 被引量:4
7
作者 赵杰 王兵 +4 位作者 骆梅 莫黎杰 李慧 刘迪 陆海 《北京林业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期64-74,共11页
【目的】天冬氨酸蛋白酶属于蛋白水解酶家族,为了解析毛白杨天冬氨酸蛋白酶PtoAED3在植物生长发育中的分子调节机制,利用GST-pull down联合质谱技术,对PtoAED3的互作蛋白进行鉴定和分析。【方法】通过同源克隆获得了毛白杨PtoAED3的CDS... 【目的】天冬氨酸蛋白酶属于蛋白水解酶家族,为了解析毛白杨天冬氨酸蛋白酶PtoAED3在植物生长发育中的分子调节机制,利用GST-pull down联合质谱技术,对PtoAED3的互作蛋白进行鉴定和分析。【方法】通过同源克隆获得了毛白杨PtoAED3的CDS序列,构建含GST标签的原核表达载体pGEX-4T-PtoAED3。使用IPTG诱导GST-PtoAED3融合蛋白表达后,利用GST标签对PtoAED3蛋白进行纯化,纯化后的PtoAED3蛋白与毛白杨植株总蛋白共孵育,应用GST-pull down技术获得毛白杨总蛋白中与PtoAED3蛋白相互作用的候选蛋白,随后通过质谱技术对筛选到的候选蛋白进行鉴定与分析。【结果】通过质谱技术鉴定这些蛋白的氨基酸序列,共筛选出128个与PtoAED3特异性结合的候选互作蛋白,这些互作蛋白涉及到细胞进程、代谢过程、应激反应、生物调节、发育过程等多个生物学过程。【结论】通过GSTpull down实验联合质谱技术,筛选出毛白杨中与PtoAED3互作的候选蛋白,为研究毛白杨PtoAED3与底物或复合物的互作及其影响毛白杨生长发育的分子调节机制提供了初步方向。 展开更多
关键词 PtoAED3 gst-pull down 质谱 互作蛋白
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GST pull-down联合质谱分析技术筛选鸡NOS2的互作蛋白 被引量:2
8
作者 周鑫琦 王颖洁 +1 位作者 张文慧 张亚妮 《中国家禽》 北大核心 2020年第9期19-25,共7页
为了筛选NOS2在鸡雄性生殖细胞形成过程中的互作蛋白,通过克隆NOS2序列,构建pGEX-6p-NOS2原核表达载体且诱导表达NOS2蛋白,采用GST pull-down联合质谱分析技术筛选与鸡NOS2相互作用的蛋白质。结果显示:经GST pull-down质谱分析鉴定到31... 为了筛选NOS2在鸡雄性生殖细胞形成过程中的互作蛋白,通过克隆NOS2序列,构建pGEX-6p-NOS2原核表达载体且诱导表达NOS2蛋白,采用GST pull-down联合质谱分析技术筛选与鸡NOS2相互作用的蛋白质。结果显示:经GST pull-down质谱分析鉴定到316个与鸡NOS2相互作用的候选蛋白质,其中12个高评分蛋白具有相同的功能注释,参与精子运动调控,且主要分布在细胞质、细胞核等细胞组分中,可能通过与其它蛋白质、核酸等分子结合而参与MAPK、Notch等信号通路;质谱分析还发现GOT1蛋白与NOS2互作最为明显,该蛋白参与Notch信号通路,后续将作为重点候选互作蛋白以探究其与NOS2蛋白的互作方式。该结果为进一步探究NOS2在鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化中的调控机制奠定了实验基础。 展开更多
关键词 NOS2 gst pull-down 质谱分析技术 蛋白质相互作用
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利用GST pull-down联合质谱技术鉴定H7N9禽流感病毒PA-X的互作蛋白 被引量:1
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作者 徐国双 姜童潇 +3 位作者 郭艺迪 段铭 张茂林 关振宏 《广东农业科学》 CAS 2022年第1期121-127,共7页
【目的】为探究H7N9亚型禽流感病毒(AIV)PA-X蛋白的功能,采用GST pull-down联合质谱技术筛选与鉴定与PA-X相互作用的宿主蛋白。【方法】构建PA-X的重组表达载体pGEX-4T-PA-X,转化大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白,并利用GST亲合树脂进... 【目的】为探究H7N9亚型禽流感病毒(AIV)PA-X蛋白的功能,采用GST pull-down联合质谱技术筛选与鉴定与PA-X相互作用的宿主蛋白。【方法】构建PA-X的重组表达载体pGEX-4T-PA-X,转化大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白,并利用GST亲合树脂进行纯化得到GST-PA-X融合蛋白。利用GST pull-down技术,将GST-PA-X和GST对照蛋白分别与A549细胞裂解液总蛋白进行体外孵育,得到的蛋白复合物经SDS-PAGE分离后进行质谱检测分析。【结果】经GST pull-down筛选与质谱分析鉴定后得到39个高可信度的可能与PA-X互作的候选蛋白质。通过GO注释和KEGG等通路富集分析发现,这些蛋白主要参与RNA的代谢及加工、mRNA翻译及运输、多肽生物合成及基因表达的转录后调节等生物学过程。对其中评分最高的蛋白Hsp70-2与PA-X的相互作用作进一步验证,免疫荧光试验结果表明Hsp70-2与PA-X可以在细胞浆中共定位。【结论】利用GST pulldown联合质谱技术筛选到39种与PA-X互作的候选蛋白,且经免疫荧光试验证明候选蛋白Hsp70-2与PA-X存在共定位,为深入探讨PA-X在AIV生命周期中的作用机制奠定基础。 展开更多
关键词 禽流感病毒H7N9 PA-X gst pull-down 质谱 Hsp70-2 蛋白互作
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一种基于荧光检测的GST-pull down改进方法的建立及对Atsttrin-TNFR2相互作用的分析 被引量:1
10
作者 王重喜 罗学刚 +3 位作者 李朋彦 陈小颖 周浩 张同存 《天津科技大学学报》 CAS 北大核心 2015年第1期34-40,共7页
创建一种基于荧光检测的GST-pull down改进方法,用于蛋白质间相互作用分析.利用已确定具有相互作用的Atsttrin和TNFR2蛋白对作为实验对象,分别构建GST-Atsttrin和TNFR2-EYFP融合蛋白的原核和真核表达体系.将纯化的GST-Atsttrin与TNFR2-E... 创建一种基于荧光检测的GST-pull down改进方法,用于蛋白质间相互作用分析.利用已确定具有相互作用的Atsttrin和TNFR2蛋白对作为实验对象,分别构建GST-Atsttrin和TNFR2-EYFP融合蛋白的原核和真核表达体系.将纯化的GST-Atsttrin与TNFR2-EYFP蛋白孵育后,经离心收集复合物,通过酶标仪检测其荧光值,从而分析Atsttrin和TNFR2间的相互作用.通过荧光值的检测成功分析了Atsttrin和TNFR2间的相互作用,荧光值的检测可代替传统方法中的Western blot分析,从而简化GST-pull down分析步骤、降低操作难度、并可对缺乏特异性抗体的靶蛋白进行有效地分析. 展开更多
关键词 蛋白质相互作用 荧光检测 gst-pull DOWN
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GST pull-down结合质谱技术鉴定Muted蛋白相互作用蛋白
11
作者 郝振华 李巍 《医学分子生物学杂志》 CAS 2021年第6期409-414,共6页
目的鉴定Muted蛋白相互作用蛋白。方法表达并纯化GST-Muted蛋白融合蛋白,与小鼠脑组织蛋白共孵育,银染获得与Muted互作的蛋白条带,利用质谱技术获得这些条带的氨基酸序列,鉴定Muted的相互作用蛋白。结果初步鉴定出31个与Muted特异结合... 目的鉴定Muted蛋白相互作用蛋白。方法表达并纯化GST-Muted蛋白融合蛋白,与小鼠脑组织蛋白共孵育,银染获得与Muted互作的蛋白条带,利用质谱技术获得这些条带的氨基酸序列,鉴定Muted的相互作用蛋白。结果初步鉴定出31个与Muted特异结合的互作蛋白,包括外泌体蛋白、细胞骨架蛋白及马达蛋白等,进一步应用免疫共沉淀技术验证了Muted与Stxbp1的相互作用。结论从小鼠脑组织初步鉴定了Muted蛋白的结合蛋白,为进一步研究Muted蛋白在LDCVs形成和分泌过程中的功能及机制提供了新的线索。 展开更多
关键词 大致密核心颗粒 gst pull-down 质谱 Muted蛋白
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GST pull-down方法寻找组蛋白去乙酰化酶的互作蛋白研究
12
作者 宫艳超 张荟 赵伟伟 《天津化工》 CAS 2018年第1期17-20,共4页
用GST pull-down方法寻找组蛋白去乙酰化酶(HDACs)的互作蛋白,发现了HDAC8新的互作蛋白烯醇酶ENO1,ENO1在糖代谢过程中发挥着重要作用,ENO1参与HDAC8复合物发挥作用的过程。
关键词 gst pull-down 组蛋白去乙酰化酶 互作蛋白
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小鼠IL-17A-GST融合蛋白的克隆表达 被引量:4
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作者 张阳 张晋渝 +6 位作者 石云 赵卓 刘晓斐 庄园 张卫军 郭刚 邹全明 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期757-759,共3页
目的:构建含有小鼠IL-17A(mIL-17A)基因的重组原核表达载体,获得高效表达mIL-17A的基因工程菌,以及较高产量的mIL-17A蛋白。方法:以PMA活化后小鼠脾脏单个核细胞的总RNA逆转录合成的cDNA为模板,PCR法扩增mIL-17A的编码序列,并分别亚克隆... 目的:构建含有小鼠IL-17A(mIL-17A)基因的重组原核表达载体,获得高效表达mIL-17A的基因工程菌,以及较高产量的mIL-17A蛋白。方法:以PMA活化后小鼠脾脏单个核细胞的总RNA逆转录合成的cDNA为模板,PCR法扩增mIL-17A的编码序列,并分别亚克隆至pMD18-T载体和原核表达载体pGEX-4T-1中,经酶切和DNA测序鉴定后,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果:PCR产物大小及其双酶切鉴定均证明所克隆的基因是mIL-17A,DNA序列测定进一步证实与GenBank报道的序列完全一致。成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1/mIL-17A,并在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约40000的具有可溶性的融合蛋白,且Westernblot证实确为目的蛋白。结论:成功构建了基因重组体pGEX-4T-1/mIL-17A;并制备出可溶性IL-17A-GST融合蛋白。 展开更多
关键词 白细胞介素-17 A RT—PCR gst融合蛋白 可溶性表达
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家蚕追寄蝇谷胱甘肽硫转移酶GST1-1的特性分析及其在灭蚕蝇胁迫下的活性变化 被引量:2
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作者 王闪闪 王耒耒 +7 位作者 陈诺婧依 Zufan Bekele Kassa 张彩红 王梅仙 朱娟 沈兴家 沈中元 唐顺明 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期198-208,共11页
家蚕追寄蝇(Exorista sorbillans Wiedemann)寄生家蚕幼虫导致蝇蛆病的发生。谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase, GST)是一类多功能酶家族,对昆虫在解毒、杀虫剂抗性、氧化应激保护等方面起到重要的作用。本文以家蚕追寄蝇为... 家蚕追寄蝇(Exorista sorbillans Wiedemann)寄生家蚕幼虫导致蝇蛆病的发生。谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase, GST)是一类多功能酶家族,对昆虫在解毒、杀虫剂抗性、氧化应激保护等方面起到重要的作用。本文以家蚕追寄蝇为实验材料,使用RACE技术,获得了家蚕追寄蝇谷胱甘肽硫转移酶基因的全长cDNA序列,将其命名为EsGST1-1(GenBank:OK104864)。EsGST1-1全长813 bp,包含一段627 bp完整开放阅读框(ORF),编码208个氨基酸残基,分子质量为23.58 kD,等电点为5.498,该蛋白属于GST的Delta类家族。序列比对结果显示,EsGST1-1与丝光绿蝇(Lucilia sericata)的GST基因亲缘关系最近。进一步检测了家蚕追寄蝇EsGST1-1基因在不同发育时期和不同组织的表达模式,结果显示在卵产后0 h、幼虫脂肪体和表皮、蛹期第6天以及雌雄成虫的腹部与足部中EsGST1-1高量表达。此外,利用原核体外诱导表达获得了EsGST1-1的重组蛋白。酶活试验结果显示EsGST1-1酶活性为0.820 4 U/mg。热稳定性实验结果显示EsGST1-1在30~40℃时活性最高,随温度的升高活性下降。对灭蚕蝇胁迫下的GST活性测定发现:杀虫活性呈剂量依赖效应;寄蝇谷胱甘肽硫转移酶活力与灭蚕蝇剂量呈负相关;EsGST1-1基因的表达量与灭蚕蝇剂量呈负相关。上述研究结果为进一步开发防治蝇蛆病新型药剂提供基础信息。 展开更多
关键词 家蚕追寄蝇 gst1-1 基因克隆 酶学特性 活性分析
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GST-p43/AIMP1融合蛋白表达和纯化以及与NF-L的相互作用
15
作者 张珍珍 尹延青 +1 位作者 周嘉伟 乐卫东 《上海交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期580-584,共5页
目的构建人p43/AIMP1蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达纯化,通过GST-pulldown方法验证其与神经中间丝轻链(NF-L)的体外直接相互作用。方法以重组质粒pcDNA3.1-p43为模板,扩增p43/AIMP1基因,产物经纯化回... 目的构建人p43/AIMP1蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达纯化,通过GST-pulldown方法验证其与神经中间丝轻链(NF-L)的体外直接相互作用。方法以重组质粒pcDNA3.1-p43为模板,扩增p43/AIMP1基因,产物经纯化回收后与原核表达载体pGEX4T-1连接构建成新载体GST-p43/AIMP1,经鉴定完全正确后转化大肠埃希菌BL21(DE3),通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,并纯化获得目的蛋白;将myc-NF-L体外转染HEK293T细胞,利用GST pull-down原理和方法验证人p43蛋白与神经中间丝轻链蛋白NF-L之间的相互作用。结果酶切鉴定和测序结果显示,成功构建了GST-p43/AIMP1融合蛋白原核表达载体;考马斯亮蓝染色和Western blotting结果显示,成功获得有生物活性的GST-p43/AIMP1融合蛋白;GST pull-down实验结果证实,p43/AIMP1与NF-L存在直接相互作用。结论获得有生物活性的GST-p43/AIMP1蛋白,并成功应用GST pull-down方法证实p43/AIMP1与NF-L在体外存在直接的相互作用。 展开更多
关键词 p43/AIMP1 蛋白表达纯化 gst pull-down 神经中间丝轻链蛋白
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Effect of arginine on stability of GST-ZNF191(243-368) 被引量:1
16
作者 Dong Xin Zhao Zhong Xian Huang 《Chinese Chemical Letters》 SCIE CAS CSCD 2007年第3期355-356,共2页
For better understanding the chemical or biological information of ZNF191 (243-368), we expressed the fusion protein of GST and ZNF191 (243-368), and used it to obtain the binding DNA sequence of this zinc finger ... For better understanding the chemical or biological information of ZNF191 (243-368), we expressed the fusion protein of GST and ZNF191 (243-368), and used it to obtain the binding DNA sequence of this zinc finger protein. But in the process of expression and purification, we found this fusion protein slowly degradated. For resolving this problem, we simultaneously added charged amino acids L-Arg and L-Glu to the solution of fusion protein, and demonstrated that this method can dramatically increase the stability of this fusion protein. This method can make the fusion protein suitable for the continuous works, especially for situations where high protein concentration and long-term stability without precipitate and degradation of protein are required. 展开更多
关键词 ZNF191(243-368) gst STABILITY L-ARG L-Glu
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基于CNN-GRU并联网络的海上风电支撑结构损伤识别
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作者 李行健 刁延松 +1 位作者 吕建达 侯敬儒 《振动与冲击》 EI CSCD 北大核心 2024年第20期229-237,共9页
利用振动响应和深度学习进行结构损伤识别时,会遇到需要较多测点数据、损伤识别准确率不高以及网络容易发生过拟合等问题。为此,提出了一种基于卷积神经网络-门控循环单元(convolutional neural networks-gated recurrent unit,CNN-GRU... 利用振动响应和深度学习进行结构损伤识别时,会遇到需要较多测点数据、损伤识别准确率不高以及网络容易发生过拟合等问题。为此,提出了一种基于卷积神经网络-门控循环单元(convolutional neural networks-gated recurrent unit,CNN-GRU)神经网络并联网络的结构损伤识别新方法。首先,对响应信号进行广义S变换(generalized S-transform,GST)得到其时频图像。然后,分别利用CNN和GRU从时频图像和响应信号中提取时频域特征和时序特征,并将时频域特征和时序特征拼接后输入全连接层和Softmax分类器中进行结构损伤识别。位移激励下的海上风电支撑结构模型试验数据验证结果表明,该方法仅需要一个测点的响应信号,与其他同类方法相比具有更高的识别准确率和效率。 展开更多
关键词 卷积神经网络-门控循环单元(CNN-GRU)并联网络 结构损伤识别 深度学习 海上风电支撑结构 广义S变换(gst)
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GST沉降技术验证弓形虫醛缩酶与肌动蛋白的相互作用 被引量:6
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作者 郑斌 尹志奎 +2 位作者 何蔼 李卓雅 詹希美 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期363-367,共5页
目的通过GST沉降技术(GST pull-down)验证刚地弓形虫醛缩酶(aldolase)与肌动蛋白(actin)的相互作用。方法 PCR扩增弓形虫cDNA中aldolase和actin基因,分别亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1和pET30a,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),1 mmol/L异丙... 目的通过GST沉降技术(GST pull-down)验证刚地弓形虫醛缩酶(aldolase)与肌动蛋白(actin)的相互作用。方法 PCR扩增弓形虫cDNA中aldolase和actin基因,分别亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1和pET30a,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,亲和层析法纯化表达产物。采用腹部皮内多点注射免疫SD大鼠15只,首次免疫Actin-His6蛋白量为200μg/只,第2次起免疫蛋白量为100μg/只,共免疫4次,每次间隔7 d,末次免疫后5 d收集心脏血,制备Actin-His6抗血清。以纯化的GST-Aldolase蛋白作为探针蛋白与Actin-His6蛋白液进行GST沉降实验,实验产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析。结果获得了弓形虫aldolase和actin基因序列,构建了相应的原核表达载体。表达并纯化了GST-Aldolase和Actin-His6蛋白。Actin-His6蛋白免疫SD大鼠后获得其抗血清,经抗体亲和纯化柱纯化,获得Actin-His6多克隆抗体。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,GST沉降实验产物中的蛋白条带可被Aldolase-His6多克隆抗体和Actin-His6多克隆抗体识别。结论弓形虫醛缩酶与肌动蛋白存在相互作用。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 醛缩酶 肌动蛋白 gst沉降技术 蛋白相互作用
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酵母双杂交筛选与蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白--泛素-52氨基酸融合蛋白的鉴定 被引量:3
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作者 陈碧 骆艳婷 +1 位作者 刘新光 梁念慈 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期826-832,共7页
蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶.为研究CK2α′亚基在精子发生中的作用机制,将构建于pACT2质粒的人睾丸cDNA文库和人蛋白激酶CK2α′为诱饵蛋白进行酵母双杂交实验.以初步筛选与人蛋白激酶CK2α... 蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶.为研究CK2α′亚基在精子发生中的作用机制,将构建于pACT2质粒的人睾丸cDNA文库和人蛋白激酶CK2α′为诱饵蛋白进行酵母双杂交实验.以初步筛选与人蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白的阳性候选克隆,筛选获得8个阳性克隆,其中1个与人泛素-52氨基酸融合蛋白基因(UBA52)的cDNA序列有高度同源性(100%).GST pull-down实验在细胞外进一步证实了CK2α′与UBA52之间存在相互作用.本实验证明,人泛素-52氨基酸(UBA52)融合蛋白是人CK2α′亚基的相互作用蛋白,它们之间的相互作用对精子发生机制的影响尚不清楚,进一步分子机制研究正在进行中. 展开更多
关键词 人蛋白激酶CK2α′ 酵母双杂交系统 睾丸 人泛素-52氨基酸融合蛋白(UBA52) gst pull-down
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柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1潜在子孢子互作蛋白的筛选 被引量:3
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作者 崔晓霞 黄兵 +7 位作者 赵其平 韩红玉 朱顺海 徐帅兵 谢雨翔 唐敏 杨志远 董辉 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2017年第3期61-67,共7页
为了筛选与柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1(Eimeria tenella apical membrance antigen 1,EtAMA1)存在互作的子孢子蛋白,以柔嫩艾美耳球虫子孢子c DNA为模板,PCR扩增EtAMA1基因胞外区,将扩增产物与p GEX-6P-1连接,构建原核表达质粒p GEX-6P-1... 为了筛选与柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1(Eimeria tenella apical membrance antigen 1,EtAMA1)存在互作的子孢子蛋白,以柔嫩艾美耳球虫子孢子c DNA为模板,PCR扩增EtAMA1基因胞外区,将扩增产物与p GEX-6P-1连接,构建原核表达质粒p GEX-6P-1-EtAMA1,表达、纯化重组蛋白EtAMA1-GST。纯化的重组蛋白经Western blot验证,结果显示在75 k Da处有单一的目的条带,证实了所获得的蛋白为EtAMA1-GST融合蛋白。将EtAMA1-GST蛋白、GST蛋白和PBS分别与谷胱甘肽琼脂糖珠孵育后,再分别与子孢子裂解物共孵育,洗脱液经SDS-PAGE分析后,结果显示三者之间的条带明显不同。将差异条带切下进行质谱分析,对获得的蛋白质肽段与Uniprot中鸡球虫蛋白质数据库进行Blast比对,初步获得了10个与EtAMA1存在潜在互作的柔嫩艾美耳球虫子孢子蛋白,包括微线体蛋白、糖酵解酶类、肌动蛋白相关因子以及一些保守蛋白等,他们广泛参与了虫体的入侵、发育、能量代谢等生物学过程。研究结果为进一步阐明EtAMA1在球虫入侵宿主细胞中发挥重要作用的分子机制奠定了基础。 展开更多
关键词 柔嫩艾美耳球虫 顶膜抗原-1 gst pull-down 相互作用蛋白
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