GST-P58^(IPK)融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定

以RT-PCR方法扩增目的基因P58IPK,将其克隆至原核表达质粒pGEX-6p-1。将所构建的pGEX-6p-1-P58IPK重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)并诱导表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE、Western-blot及体外活性鉴定。结果显示,大肠杆菌细胞经诱导表达出相对分子质量约为85 000的蛋白,与GST-P58IPK融合蛋白大小相符;Western-blot显示该融合蛋白能够被抗GST的抗体特异性识别,磷酸化试验表明GST-P58IPK融合蛋白能够抑制PKR的体外磷酸化。结果表明,在大肠杆菌表达系统中表达了有活性的GST-P58IPK融合蛋白,为PKR信号通路的研究奠定了基础。

牛环形泰勒虫裂殖子/梨浆虫表面抗原基因非疏水区的克隆及GST-P27重组蛋白的高效表达

试验据GenBank登载的牛环形泰勒虫裂殖子/梨浆虫表面抗原(the merozoite/piroplasm surface antigen,Tams1)基因序列(登录号:AF214842),设计1对特异性引物,经PCR扩增出696bp的Tams1基因片段,将其插入pGEX-4T-2表达载体,提取质粒进行双酶切鉴定并测序,同源性达98%;将插入阳性质粒的BL21(DE3)菌种诱导表达重组蛋白,经优化后在37℃、0.5mmol/L IPTG诱导4h的表达条件下获得了表达量达1.39mg/mL的可溶性融合蛋白,大小为53ku;表达产物在Glutathione Sepharose 4B柱上纯化后,免疫印迹检测结果表明重组蛋白GST-P27具有良好的反应原性。

性激素对大鼠诱发肝癌中胎盘型谷胱甘肽S-转移酶(GST-P)表达的影响

本实验利用Solt-Farber顺序诱发大鼠肝癌,观察肝组织中GST活性及GST-P含量在化学诱癌中的变化,并观察性激素对大鼠化学诱发肝癌的早期病变中GST-P表达的作用。结果显示无论是GST活性或GST-P的含量,在诱癌至第三周开始升高,第五周升至最高。利用此模式,选择诱癌至第五周,免疫组化法检测各种处理后肝组织中GST-P的表达。发现睾丸假切除的雄性大鼠经化学诱癌后,肝中有高的GST-P表达,睾丸假切除的雄性大鼠诱癌合并雌二醇处理,明显降低肝组织GST-P阳性灶的面积和数量;合并睾丸酮处理,虽减少GST-P阳性灶的面积,但其数量略有升高。与睾丸假切除后诱癌的雄性大鼠相比,切除睾丸的大鼠经诱癌,有更低的GST-P阳性灶的面积;睾丸切除合并雌二醇处理,GST-P阳性灶的面积进一步降低。与仅化学诱癌的卵巢假切除雌性大鼠比,卵巢切除鼠诱癌后,GST-P阳性灶的面积稍有增加;对卵巢切除合用睾丸酮的大鼠诱癌,阳性灶的面积进一部增加。无论性腺切除与否,雄性大鼠比雌性大鼠有更高的GST-P表达。这些结果提示雌激素可抑制而雄激素则可促进化学诱癌大鼠肝中GST-P的表达。这一结果可能与临床上男性较女性易患肝癌有关。

去辣椒素敏感性感觉神经对大鼠急性心肌缺血心脏SOD1和GST-P表达的影响

目的研究去辣椒素敏感性感觉神经对大鼠急性心肌缺血心脏Cu—Zn超氧化物岐化酶（SOD1）和谷胱甘肽S一转移酶-P（GST—P）表达的影响。方法将新生48hSD雄性乳鼠随机分为正常组和去辣椒素敏感性感觉神经组，去辣椒素敏感性感觉神经组用50mg·kg。。辣椒素皮下注射，正常组用溶剂皮下注射，待乳鼠复苏后置于鼠笼，饲养至250～290g造急性心肌缺血模型。各组再分为假手术组（正常假手术组、去辣椒素敏感性感觉神经假手术组）和急性心肌缺血组（正常心肌缺血组、去辣椒素敏感性感觉神经心肌缺血组）两个亚组。在缺血6h时各组大鼠均被处死，解剖取左室壁心肌组织，用于提取总蛋白，Westernblotting检测各组大鼠SOD1、GST—P蛋白质的相对表达量。结果与正常假手术组比较，正常心肌缺血组SOD1、GST—P表达显著降低（P〈0．05，P〈0．01）；去辣椒素敏感性感觉神经假手术组SOD1表达显著降低（P〈0．01），GST—P表达差异无统计学意义（P〉0．05）。与去辣椒素敏感性感觉神经假手术组比较，去辣椒素敏感性感觉神经心肌缺血组SOD1、GST—P表达差异均无统计学意义（P〉0．05）。与正常心肌缺血组比较，去辣椒素敏感性感觉神经心肌缺血组SOD1表达显著降低（P〈0．05），GST—P表达差异无统计学意义（P〉0．05）。结论辣椒素敏感性感觉神经对急性心肌缺血心脏中SOD1、GST—P在一定程度上有调控作用。

碳酸锂对抗化学诱导大鼠肝癌前病变过程中GST-P的表达及意义

目的观察碳酸锂 (Li2 CO3)对抗黄曲霉毒素B1(AFB1)诱发的大鼠肝癌前病变的组织形态学变化及胎盘型谷胱甘肽硫转移酶 (GST P)的表达。方法采用肝癌发生的动物模型。 144只Wistar大鼠 ,随机分为A、B、C、D四组 (A组为阴性对照组 ;B组为阳性对照组 ;C组为Li2 CO3 同时给药组 ;D组为Li2 CO3 先期给药组 ) ,于实验第 6、9、10周分批断头处死动物 ,取动物肝脏进行肝组织学检查和GST P的免疫组化染色。结果C、D两组动物健康状况明显改善 ,肝癌前期病变程度明显减轻 ;肝癌标志酶GST P表达减弱 (P <0 0 1) ;D组动物一般状况明显好于C组 ,GST P阳性灶的下降趋势优于C组。结论Li2 CO3 对化学诱导肝癌有明显对抗作用 ,并有一定的预防作用。GST

3种化学诱导物对大鼠GST-P基因表达的影响及机理

大鼠谷胱甘肽S_转移酶P(GST_P)基因可被多种化学致癌物诱导表达 .采用基因诱导实验、共转染报告质粒瞬时表达实验、凝胶阻滞实验和分子杂交实验探讨了 3种化学物诱导GST_P基因表达的机理 .结果表明 ,佛波酯 (TPA)、甲基丙烯酸环氧丙酯 (GMA)和H2 O2 对GST_P基因表达的影响及其机理不甚相同 :TPA和GMA主要通过激活AP_1或相应转录因子与GPEⅠ增强子元件相作用而促进GST_P表达 ,H2 O2

微囊藻毒素LR和黄曲霉毒素B＿1对肝脏促癌作用的实验研究

为评价微囊藻毒素ＬＲ（ＭＣＬＲ）和黄曲霉毒素Ｂ＿１（ＡＦＢ＿１）对大鼠肝脏的促癌作用,采用二阶段中期动物试验模型进行了研究。６周龄雄性Ｆｉｓｈｅｒ３４４大鼠腹腔注射二乙基亚硝胺（ＤＥＮ,２０Ｏｍｇ／ｋｇ）作为起始剂,在第２周未腹腔注射ＡＦＢ＿１（０.５ｍｇ／ｋｇ）,第３周至第８周每周２次腹腔注射ＭＣＬＲ（ｌ或１０μｇ／ｋｇ）。所有大鼠在第３周末进行２／３部分肝切除,第８周末全部处死,通过在肝切片上测量单位面积肝组织中胚胎型谷胱甘肽８转移酶（ＧＳＴ－Ｐ）阳性灶的数量和面积作为肝脏癌前病变的指标。结果表明ＭＣＬＲ和ＡＦＢ＿１在ＤＥＮ起始下能显著增加ＧＳＴ－Ｐ阳性灶的数量和面积,ＭＣＬＲ单独作用也能显著增加ＧＳＴ－Ｐ阳性灶的面积,提示ＭＣＬＲ为大鼠肝脏的促癌剂,并且ＭＣＬＲ与ＡＦＢ＿１具有协同促癌作用。这对肝癌高发区动员居民改饮沟塘水为深井水有现实意义。

护肝片通过抑制肝纤维化而阻碍肝细胞癌发展

目的探讨在DEN诱导的大鼠肝癌模型中,护肝片在肝纤维化—肝癌发展过程中所产生的影响。方法雄性SD大鼠90只随机分为二乙基亚硝胺(diethylinitrosamine,DEN)组,正常对照组,护肝片组(921 mg·kg-1)。DEN组和护肝片组给予0.2%DEN溶液灌胃,按体重10 mg·kg-1给药,每周5次,至14周,对照组给予溶媒。护肝片组同时灌胃(ig)给予护肝片溶剂(羟甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液配制),每日1次,直至16周。收集所有大鼠血液样本,进行血清学检测。通过病理组织学检查检测肝纤维化的程度。采用试剂盒检测肝组织中羟脯氨酸的含量。采用免疫组化法检测肝组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及胎盘型谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-transferase placenta,GST-P)蛋白的表达。结果 DEN能够成功的诱导大鼠在12周发生肝纤维化,在16周发生肝癌。护肝片能够显著抑制肝纤维化—肝癌的发生。在12周时,护肝片能显著降低与肝功能相关的血清学指标以及α-SMA的过度表达,降低纤维化的程度。在16周时,护肝片能显著降低DEN诱导的大鼠肝癌的发生率和多样性。此外护肝片还能降低癌前病变指标γ-谷氨酰转肽酶(gamma-glutamyl transferase,GGT)和GST-P蛋白的表达。结论护肝片能够通过降低癌前病变指标GGT和GST-P的表达来阻止DEN诱导的肝癌的发生,同时也能减轻肝纤维化的程度,提示GGT与GST-P表达增强与肿瘤的发生密切相关,可能可以作为由纤维化进一步发展为肿瘤的标志,或者有可能成为预测肝癌发生的指标。

青海西宁藏獒巴贝西虫病的血清学调查

用基于重组的犬B.gibsoni P50蛋白作为ELISA诊断抗原,对来自青海省西宁地区的5个藏獒养殖基地的118份藏獒血清,进行了犬巴贝西虫病的血清学诊断。经过对所收集的118份牧羊犬血清抗体的检测,共检出牧羊犬阳性血清12份,阳性率为10.17%。结果初步表明,西宁地区部分藏獒养殖基地中存在犬B.gibsoni感染。

GST-π和P-gp在胃癌中的表达及其临床意义

目的探讨耐药蛋白GST-π和P-gp在胃癌中的表达及其与胃癌临床病理特征的关系。方法用免疫组化法检测209例胃癌组织GST-π和P-gp的表达情况,并收集临床病理相关资料作回顾性分析。结果 GST-π表达阳性率为81.82%(171/209),与淋巴结转移数目有关(P<0.05);P-gp表达阳性率为79.90%(167/209),在印戒细胞癌中表达率较高(P<0.05);GST-π和P-gp表达具有相关性(r=0.241,P<0.05)。结论 GST-π和P-gp的表达与胃癌的生物学行为有一定的相关性。

TopoⅡα、GST-π、P-gp在卵巢癌化疗耐药中的作用

目的探讨TopoⅡα、GSTπ、Pgp在卵巢癌化疗耐药中的作用。方法采用免疫组化SP法、计算机图像分析技术对80例卵巢癌、20例良性上皮性卵巢肿瘤、20例正常卵巢组织中TopoⅡα、GSTπ、Pgp的表达进行检测。结果卵巢癌中TopoⅡα、GSTπ、Pgp的表达显著高于正常组及良性肿瘤组,P<0.05。TopoⅡα、GSTπ的表达与肿瘤分化程度有关,分化越差表达越高,P<0.05;Pgp的表达与多种病理因素无关,P>0.05。术前化疗组GSTπ、Pgp的阳性表达率显著高于术前未化疗组,P<0.05。结论TopoⅡα、GSTπ、Pgp在卵巢癌耐药中发挥重要作用,这三项指标的联合检测对制定合理的化疗方案具有积极的指导意义。

P-gp、GST-л、TopoⅡ在胃癌组织中的表达及临床意义

目的 探讨P gp、GST л、TopoⅡ在胃癌组织中的表达及临床意义。 方法 采用免疫组化方法研究了P gp、GST л、TopoⅡ在胃癌组织中的表达情况。 结果 P gp、GST л、TopoⅡ在胃癌组织中的表达率分别为 5 9.74 %、6 7.5 3%、83.12 %。除TopoⅡ的表达与组织学类型有关外 (P <0 .0 0 1) ,其余与各项临床病理参数均无关 (P >0 .0 5 )。结论 胃癌组织中存在着P gp、GST л、TopoⅡ表达水平的变化 ,临床检测P gp、GST л、TopoⅡ对胃癌化疗方案的制定具有重要的指导意义。

甲基叔丁基醚对原癌基因和功能基因表达的影响

甲基叔丁基醚（ＭＴＢＥ）是一种新型的汽油添加剂，被用来提高汽油燃烧效率，减少汽车尾气中有害物质的排放。ＭＴＢＥ具有一定的动物致癌性，但其机制目前并不清楚。本研究采用免疫组织化学方法，检测了ＭＴＢＥ对体外培养的ＮＩＨ３Ｔ３细胞中ｃ－ｍｙｃ和ｐ２１蛋白表达的影响；采用点杂交方法，从ＲＮＡ水平检测了ＭＴＢＥ亚慢性染毒大鼠肝组织中原癌基因ｃ－ｍｙｃ基因和功能基因ＧＳＴ－Ｐ基因的表达情况。免疫组化结果显示，ＭＴＢＥ可诱导ｃ－ｍｙｃ基因的高表达，对ｐ２１蛋白的表达未见明显影响。点杂交结果显示，ＭＴＢＥ可明显诱导大鼠肝组织中ｃ－ｍｙｃ基因的高表达，而对ＧＳＴ－Ｐ基因的表达未见明显影响。上述结果提示，ＭＴＢＥ可诱导细胞中ｃ－ｍｙｃ基因表达活性增高，可能是其动物致癌性的机制之一。

卵巢癌中TopoⅡα、GST-π、Pgp表达与化疗反应性及预后的关系

目的:研究卵巢癌中拓扑异构酶Ⅱα(topoisomeraseα,TopoⅡα)、谷胱甘肽S转移酶π(glutathioneStranserasesπ,GSTπ)、P糖蛋白(Pglycoproein,Pgp)的表达与化疗反应性及预后的关系。方法:采用免疫组化SP法,计算机图象分析技术对80例卵巢癌、20例良性上皮性卵巢肿瘤、20例正常卵巢组织中TopoⅡα、GSTπ、Pgp的表达进行检测。结果:GSTπ、Pgp阳性组患者的化疗反应率显著低于阴性组(分别为51.60%vs88.90%;43.80%vs70.80%,P<0.05)。GSTπ、Pgp阳性对耐药的预测值为48.40%、56.20%;GSTπ、Pgp阴性对化疗反应的预测值为88.90%、70.80%。TopoⅡα阴性而GSTπ、Pgp阳性组以及TopoⅡα阳性而GSTπ、Pgp阴性组患者的化疗反应率分别为33.30%、100.00%,前者显著低于后者(P<0.05)。GSTπ、Pgp阳性组患者术后生存时间均显著短于阴性组(P<0.05,P<0.01)。TopoⅡα阴性而GSTπ、Pgp阳性组患者的术后生存时间显著短于TopoⅡα阳性而GSTπ、Pgp阴性组(P<0.01),Cox多因素分析表明Pgp的表达是影响术后生存的独立因素。结论:TopoⅡα、GSTπ、Pgp的联合检测对合理制定化疗方案、预测化疗反应性及估计预后具有积极的指导意义。

应用大鼠中期肝癌试验研究DEN和2-AFF的促癌作用

目的 应用大鼠中期肝癌试验研究二乙基亚硝胺(DEN)和 2 乙酰氨基芴 (2 AAF)的促癌作用。方法 ♂SD大鼠单次ip 2 0 0mg·kg-1DEN启动 ,2wk后每天在饮水中加入 10、33、10 0 ppmDEN ,或以 2 2、6 6、 2 2mg·kg-12 AAF灌胃 ,连续 6wk。第 3周全部大鼠切除 2 /3肝 (partialhepatectomy) ,第 8周末处死 ,以免疫组化方法检测肝脏胎盘型谷胱甘肽S 转移酶 (GST P) ,以GST P阳性灶数量 /面积相对于仅DEN启动的对照组的增加 ,评价化合物的致癌性。结果 DEN和 2 AAF均引起肝GST P阳性灶数量和面积增加 ,并且显示剂量效应关系。结论 DEN和 2 AAF均具有促癌作用 ,大鼠中期肝癌试验是研究受试物促癌作用的简便、经济、有效的方法。

GST-π、P-gp和Ts在消化道肿瘤中的表达及临床意义

目的:探讨GST-π、P-gp及Ts在消化道肿瘤中的表达及其与临床病理特征的关系。方法:应用免疫组化法检测127例消化道肿瘤(32例食管癌、53例胃癌、42例结直肠癌)组织中GST-π、P-gp及Ts的表达情况,与临床病理相关资料进行回顾性分析。结果:GST-π表达阳性率80.95%、P-gp表达阳性率44.86%及Ts表达阳性率18.10%。GST-π表达、P-gp表达与年龄、性别、淋巴结转移、脉管癌栓及分化程度无关。Ts表达也与年龄、性别、淋巴结转移及分化程度无关,但与脉管癌栓有关(P<0.05)。P-gp与GST-π、Ts表达具有相关性(P<0.05)。结论:消化道肿瘤组织可表达P-gp与GST-π、Ts等耐药因子,三者表达具有相关性,GST-π、P-gp与Ts在消化道肿瘤组织中联合检测有重要的临床意义。

P-糖蛋白,GST-π,TopoⅡ在食管癌组织中的表达及其临床意义

目的：探讨P－gp、GST－π、TopoⅡ在食管癌组织中的表达及意义。方法：采用免疫组织化学方法研究了P－gp、GST－π、TopoⅡ在食管癌组织中的表达情况。结果：P－gp、GST－π在食管癌组织中的表达升高，表达率分别为58．02％和72．84％，P－gp 的高表达与淋巴结转移、癌肿浸润深度有关P＜0．05。GST－π的高表达与细胞分化程度有关P＜0．05。TopoⅡ在食管癌组织中的表达降低，表达率为61．73％，TopoⅡ的表达降低与临床病理参数无关P＞0．05。结论：食管癌组织中存在着P－gp、GST－π、TopoⅡ表达水平的变化，临床检测P－gp、GST－π、TopoⅡ对食管癌化疗方案的制定、判断预后有重要的指导意义。

乳腺癌中耐药蛋白P-gp、GST-π、Topo-Ⅱ的表达

目的明确乳腺癌中是否存在P-gp、GST-π、TopoⅡ三种原发耐药蛋白;三种耐药蛋白的表达与乳腺癌的组织类型、细胞分化程度、TNM分期是否相关;是否影响乳腺癌患者的预后。方法采用S-P免疫组化方法,检测260例乳腺癌患者中P-gp、TopoⅡ、GST-π的表达情况,同时取10例乳腺病及10例癌旁乳腺组织作对照。结果乳腺癌中三种耐药蛋白呈异质性表达。P-gp、GST-π和TopoⅡ在良性病变中弱表达,在伴有早期浸润的乳腺导管内癌和乳腺浸润性导管癌中的表达同样明显高于乳腺导管内癌;其中P-gp和GST-π表达和预后相关,差异显著(P<0.01,P<0.05)。结论乳腺癌在发生早期浸润的同时就伴随着耐药的发生;P-gp和GST-π是乳腺癌患者预后的影响因素,综合检测优于单一检测。

卵巢癌P-糖蛋白、GST-π、P^(53)、P^(185)表达对近期化疗效果的影响

目的：评价卵巢癌P-糖蛋白、P53、P185表达对近期化疗效果的影响及相互关系。方法：免疫组织化学ABC法检测49例卵巢癌P-糖蛋白、GST－π、P53、P185表达。结果：1.卵巢癌P-糖蛋白、GST－π、P53、P185表达阳性者的近期化疗有效率分别为14．3％。27．3％、41、67％、24、63％，而表达阴性者的近期化疗有效率分别为53．6％（P<O．005）、56．3％（P<0．005）、48．2％（P>0．05）、75．0％（P<0．005）。2．P-糖蛋白、P185的表达存在相关性（P＜0．05）。结论：卵巢癌P-糖蛋白、GST－π、P185的表达明显影响其近期化疗效果。P-糖蛋白、P185表达的相关性值得进一步研究。

结直肠癌组织中P-gp、GST-π、Topo-Ⅱ和p53的协同表达

目的 :探讨结直肠癌组织中P 糖蛋白 (P gp)、拓扑异构酶 (Topo Ⅱ )、谷甘胱肽 S 转移酶 (GST π)和 p5 3的表达与病理组织学分级、临床分期、淋巴结转移和生存率的相关性及其协同表达的意义。方法 :用免疫组化方法检测 136例术前未进行化疗的结直肠癌组织中P gp、GST π、Topo Ⅱ和p5 3的表达。 结果 :P gp、GST π和 p5 3的表达与病理组织学分级、淋巴结转移和临床分期无关 (P >0 0 5 ) ,与生存率明显相关 (P <0 0 1)。Topo Ⅱ的表达与本组临床病理参数均无相关性。 结论 :应用免疫组化法检测结直肠癌组织中P gp、GST π和 p5 3的表达 。