GST-P58^(IPK)融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定

以RT-PCR方法扩增目的基因P58IPK,将其克隆至原核表达质粒pGEX-6p-1。将所构建的pGEX-6p-1-P58IPK重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)并诱导表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE、Western-blot及体外活性鉴定。结果显示,大肠杆菌细胞经诱导表达出相对分子质量约为85 000的蛋白,与GST-P58IPK融合蛋白大小相符;Western-blot显示该融合蛋白能够被抗GST的抗体特异性识别,磷酸化试验表明GST-P58IPK融合蛋白能够抑制PKR的体外磷酸化。结果表明,在大肠杆菌表达系统中表达了有活性的GST-P58IPK融合蛋白,为PKR信号通路的研究奠定了基础。

P58^IPK基因在糖尿病鼠视网膜中表达的动态变化

背景糖尿病视网膜病变（DR）的分子生物学发病机制仍不清楚，以往的研究表明内质网应激相关因子在糖尿病患者外周血中呈高表达，而P58^IPK可以抑制这些因子的表达，因此P58^IPK和糖尿病之间的关系值得深人研究。目的检测P58^IPK。在糖尿病大鼠模型视网膜中的动态表达，为进一步研究P58^IPK抑制DR的机制奠定基础。方法18只sD大鼠腹腔注射60mg／kg链脲佐菌素（STZ）制作糖尿病动物模型，分别于造模后1、3、6个月各处死6只大鼠；另6只匹配的正常SD大鼠作为正常对照组。取视网膜组织采用实时定量聚合酶链反应（real—timePCR）法检测P58^IPKmRNA在大鼠视网膜中的表达，观察P58^IPKmRNA随糖尿病的发展出现的动态变化。结果造模后糖尿病组大鼠表现出多饮、多食、多尿，血糖均≥16．5mmol／L，造模成功率为100％。造模后1个月、3个月鼠视网膜中P58^IPKmRNA／β-actinmRNA的A值分别为0．800±0．005和0．975±0．008，明显高于对照组的0．725±0．006，差异有统计学意义（t=22．589、t=62．784，P〈0．05），造模后6个月鼠视网膜P58^IPK／β—actin的A值为0．671±0．004，并明显低于对照组，差异有统计学意义（t=-17．984，P〈0．05）。结论P58^IPK。参与DR的发病机制，可能具有延缓DR发生和发展的作用。