谷胱甘肽S-转移酶-肌钙蛋白I(28～110aa)表达纯化及稳定性的初步研究

目的:评估重组融合蛋白谷胱甘肽S-转移酶(GST)-肌钙蛋白I(TnI)(28～110aa)的实用价值。方法:诱导表达菌株BL21-PGEX-4T-3/TnI(84～330bp)表达GST-TnI(28～110aa),谷胱甘肽Sepharose-4B亲合层析柱纯化融合蛋白,经自动免疫分析仪检测其免疫反应性。采用双抗体夹心ELISA法检测稳定性,并与天然提纯心肌肌钙蛋白I(cTnI)抗原进行比较。结果:GST-TnI(28～110aa)融合蛋白表达水平高,具较高免疫反应性。在37℃条件下,GST-TnI(28～110aa)融合蛋白第3天免疫反应性仍保留60%,而人心肌提纯的cTnI在第3天免疫反应性几近丧失。结论:GST-TnI(28～110aa)融合蛋白具较高的免疫反应性,与天然cTnI相比较,重组GST-TnI融合蛋白稳定性好,有望作为cTnI测定的候选参考标准品。

TnI(84-330bp)稳定区基因的克隆及表达

目的克隆与表达具有稳定免疫反应性的肌钙蛋白TnI(28-110aa)片段。方法(1)PCR从心脏cDNA中扩增TnI(84-330bp)与PGEX-4T-3/TnI(84-330bp)表达载体的构建;(2)IPTG诱导BL21-PGEX-4T-3/TnI(84-330bp)表达,根据聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)判定pGEx-4T-3-TnI84-330bp融合蛋白的表达情况,并经蛋白质印迹试验(WesternBlotting)对表达产物进行验证。谷胱甘肽Sepharose-4B亲合层析柱纯化目的蛋白。结果PCR扩增出TnI(84-330bp)基因,将该基因正确地克隆到表达性载体质粒pGEX-4T-3中;可溶性表达的目的蛋白多于包涵体;肌钙蛋白I单抗能识别融合蛋白,而与GST蛋白不发生交叉反应。结论成功构建了能在BL2l中高效表达的PGEX-4T-3/TnI(84-330bp)质粒,表达的目的蛋白有特异免疫反应性。