计算机数字控制中运用GTP3自动编程技术

讨论了CNC(计算机数字控制)系统中自动编程的基本概念。

肽链释放因子识别终止密码子的机制

肽链释放因子(polypeptide release factor,RF)是参与细胞内蛋白质合成终止过程中新生肽链释放的一组重要的蛋白质,包括两类,即第一类肽链释放因子(classⅠrelease factor,RFⅠ)和第二类肽链释放因子(classⅡrelease factor,RFⅡ).关于第一类肽链释放因子识别终止密码子的机制和功能位点是目前分子细胞生物学领域的一个研究热点,第二类肽链释放因子作为一类GTP酶,在第一类肽链释放因子识别终止密码子和肽链释放过程中的协同作用也备受关注.近些年来,通过构建体内和体外的测活体系,对第一类肽链释放因子识别终止密码子的机制的研究取得了一些进展,提出了多种假说和模型,尤其是对第一类肽链释放因子的晶体结构及两类肽链释放因子复合体的空间结构的研究,为揭示真核生物细胞内蛋白质合成终止机制提供了直接的证据.

沉默RND3表达对氧糖缺失/复氧复糖损伤海马神经细胞炎症反应和细胞凋亡的影响

目的探讨沉默Rho家族GTP酶3(RND3)表达对氧糖缺失/复氧复糖(OGD/R)损伤海马神经细胞炎症反应和细胞凋亡的影响。方法使用包有沉默RND3表达的短发夹RNA(shRND3)及其阴性对照(shRND3-NC)序列的慢病毒载体分别对海马神经细胞进行转染。转染成功后对细胞进行2 h的缺氧缺糖培养再行复氧复糖建立OGD/R模型。CCK-8法检测细胞活力,RT-qPCR检测RND3及炎症和凋亡相关分子的mRNA表达,Elisa检测细胞上清液中炎症因子的浓度,Western Blot检测RND3和凋亡蛋白以及胞核内NF-κB的蛋白表达,Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果与正常细胞相比,OGD/R损伤后细胞活力降低(P<0.001),炎症因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)和NF-κB表达升高(P<0.001),促凋亡蛋白(Caspase-3和Bax)表达升高(P<0.001),抗凋亡蛋白(Bcl-2)表达降低(P<0.001),细胞的凋亡率升高(P<0.001)。与沉默RND3阴性组相比,沉默RND3后,细胞活力增加(P<0.01),炎症因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)和NF-κB表达降低(P<0.001),促凋亡蛋白(Caspase-3和Bax)表达降低(P<0.001),抗凋亡蛋白(Bcl-2)表达升高(P<0.001),细胞的凋亡率下降(P<0.001)。结论沉默RND3表达通过抑制炎症反应和细胞凋亡减轻海马神经细胞的OGD/R损伤,沉默RND3抑制炎症反应的机制可能与抑制NF-κB通路有关。

G3BP在喉鳞状细胞癌的表达及其临床意义

目的研究GTP酶激活蛋白SH3功能区结合蛋白(G3BP)在喉鳞癌组织中的表达情况及其与喉鳞癌生物学行为之间的关系。方法采用免疫组织化学方法检测91例喉鳞癌组织中G3BP的表达情况,并探讨他们与喉鳞癌的肿瘤组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移和预后的关系。结果G3BP在喉鳞癌的阳性表达率为84.7%。其表达水平与肿瘤分化程度(P=0.008)、临床分期(P=0.005)、淋巴结转移(P=0.000)及肿瘤复发转移(P=0.000)均有密切关。G3BP表达水平越高,患者术后生存时间越短(P=0.000)。结论G3BP在喉鳞癌表达与肿瘤分化程度、临床分期、淋巴结转移、肿瘤复发转移情况及患者的预后有密切关系。G3BP可作为判断喉鳞癌患者预后的有效参考指标。

G3BP和OPN在喉鳞状细胞癌的表达及其临床意义

目的研究喉鳞癌组织中GTP酶激活蛋白SH3功能区结合蛋白(G3BP)和骨桥蛋白(OPN)的表达及其与喉鳞癌生物学行为的关系。方法 91例喉鳞癌组织标本,应用免疫组织化学方法检测G3BP和OPN表达水平,分析检测结果与瘤细胞分化程度、TNM分期、淋巴结转移和预后的关系。结果 G3BP阳性率为84.7%,其表达水平与瘤细胞分化程度(P=0.008)、临床分期(P=0.005)、淋巴结转移(P=0.000)及术后肿瘤复发与转移(P=0.000)均密切相关;G3BP表达水平越高,患者术后生存时间越短(P=0.000)。OPN阳性率为76.5%,其表达水平与临床分期(P=0.035)、淋巴结转移(P=0.005)及术后肿瘤复发与转移(P=0.017)密切相关,而与瘤细胞分化程度(P=0.211)无关;OPN表达水平越高,患者术后生存时间越短(P=0.032)。G3BP与OPN的表达水平之间存在正相关(rs=0.556,P=0.000)。结论 G3BP与OPN表达水平可作为判断喉鳞癌患者预后的有效参考指标。

年龄对SAMP8小鼠不同脑区Rab3a含量的影响

目的探讨年龄对小鼠不同脑区Rab3a含量的影响。方法77只SAMP8小鼠分为4个年龄组:5、9、13、15月龄组。在进行行为学特征化后采用免疫印迹技术检测Rab3a蛋白和内参蛋白GAPDH在背海马、腹海马、额叶、顶叶和嗅球中的表达,Rab3a灰度值与GAPDH灰度值的比值作为Rab3a的相对含量。结果在腹海马中,15月龄SAMP8小鼠Rab3a的相对含量显著低于5、9、13月龄鼠(P值分别为0.014,<0.001及0.001),而背海马、额叶、顶叶和嗅球Rab3a含量在各个年龄段间差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论在生命过程中,SAMP8小鼠脑内Rab3a含量相对恒定,仅高龄小鼠有区域特异性降低。

胃癌组织中miR-200a-3p、G3BP2的表达及意义

目的研究胃癌组织中微小RNA(miRNA)-200a-3p及GTP酶激活蛋白SH3功能区结合蛋白2(G3BP2)表达及意义。方法应用qRT-PCR法检测97例份胃癌组织及其配对的癌旁正常组织(距离癌组织5 cm)中miR-200a-3p及G3BP2表达,分析miR-200a-3p、G3BP2表达差异及其与临床病理特征和预后的关系。结果与癌旁正常组织相比,胃癌组织中miR-200a-3p表达降低,而G3BP2表达升高(P均<0.05)。胃癌组织中miR-200a-3p表达与G3BP2呈显著负相关(r=-0.610,P=0.008)。胃癌组织中miR-200a-3p、G3BP2表达与肿瘤TNM分期、肿瘤分化有关(P均<0.05),而与患者性别、年龄、肿瘤大小、位置、浸润深度及淋巴结转移无关(P均>0.05)。miR-200a-3p低表达者3年总体生存率(OS)低于miR-200a-3p高表达者(P<0.05);G3BP2高表达者3年OS低于G3BP2低表达者(P<0.05)。结论胃癌组织中miR-200a-3p表达降低,而G3BP2表达升高;二者联合检测有助于患者病情判断及预后评估。

盆底肌损伤后修复过程中囊泡转运相关基因的表达

目的:探讨在阴道分娩导致盆底肌损伤的过程中与骨骼肌再生修复及囊泡转运相关的基因表达,初步阐明ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白3(ARFGAP3)等效应分子在盆底肌损伤后再生修复中的潜在作用。方法:选取12周龄的C57 BL/6健康雌性处鼠32只,通过阴道扩张加远端牵引法构建盆底肌损伤模型,分为对照组、造模1 d组、造模3 d组和造模5 d组。在基因表达综合数据库(GEO)中,以“muscle regeneration”为关键词搜索与骨骼肌再生修复相关的信息,选取GSE5413、GSE45577和GSE4693个数据集,使用GE02R在线分析工具和R软件筛选差异表达基因,在共差异表达基因中选出与胞内囊泡转运相关的10个基因(ARFGAP3、LGALS3、KDELR3、CSF1R、ANXA4、STMN1、THBS2、PLXNB2、KIF20A和EMR1)。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测盆底肌损伤修复过程中小鼠盆底肌组织中上述囊泡转运相关差异基因的表达水平。结果:在盆底肌损伤后表达水平升高的基因有ARFGAP3、STMN1、THBS2和PLXNB2。与对照组比较,造模1 d组小鼠盆底肌组织中ARFGAP3、STMN1和THBS2基因表达水平升高(P<0.05或P<0.01),造模3 d组小鼠盆底肌组织中ARFGAP3和PLXNB2基因表达水平升高(P<0.01)。在盆底肌损伤后表达水平降低的基因有CSF1R、ANXA4和EMR1。与对照组比较,造模1 d组小鼠盆底肌组织中CSF1R和EMR1基因表达水平降低(P<0.05或P<0.01);造模3 d组小鼠盆底肌组织中CSF1R和ANAX4基因表达水平降低(P<0.05),造模5 d组小鼠盆底肌组织中ANAX4基因表达水平降低(P<0.05)。在盆底肌损伤后表达水平不变的基因有LGARLS3、KDELR3和KIF20A。结论:ARFGAP3可能在盆底肌损伤后修复过程中起到重要调控作用。

Rnd3表达改变对糖尿病大鼠内皮祖细胞生物学特性的影响

目的:探讨糖尿病状态下Rho家族GTP酶3(Rnd3)表达改变对骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)一般生物学特性的影响。方法:高脂饮食联合腹腔注射链脲佐菌素建立野生型及Rnd3基因敲除杂合子(Rnd3^(+/-))SD大鼠糖尿病模型。建模成功后,分离、培养各组大鼠骨髓源性EPCs并鉴定。CCK-8法测定细胞活力,Western blot检测各组EPCs中凋亡相关蛋白caspase-3和Bcl-2的表达,Transwell实验测定迁移能力,ELISA检测各组细胞分泌的血管内皮生长因子(VEGF)的水平,Matrigel成管实验检测EPCs管样结构形成能力。结果:高脂饮食联合腹腔注射链脲佐菌素成功复制SD大鼠糖尿病模型。成功分离大鼠骨髓源性EPCs。糖尿病状态降低了EPCs的活力、迁移和旁分泌VEGF的能力,抑制了EPCs的Matrigel内成管能力,上述情况在Rnd3敲除后更明显。Rnd3敲除后Bcl-2水平下降而caspase-3表达上调。结论:Rnd3表达的维持对骨髓源性EPCs的增殖、迁移和血管生成等一般生物学特性具有正性调节作用。Rnd3表达不足加剧了糖尿病对EPCs一般生物学功能的损伤。

GTP酶激活蛋白(Src同源结构域3)结合蛋白1表达下调对人肺癌细胞A549体外迁移的抑制作用

目的研究GTP酶激活蛋白(Src同源结构域3)结合蛋白1〔GTPase activating protein(Src homology domain 3)binding protein 1,G3BP1〕是否在人非小细胞肺癌细胞系A549体外迁移中起作用,以判断该蛋白质是否可以作为抗肿瘤药物靶点。方法人非小细胞肺癌细胞系A549及乳腺癌细胞系MDA-MB-231培养于10%(V/V)的RPMI1640培养基中。以G3BP1过表达的乳腺癌细胞系MDA-MB-231作为阳性对照,采用Western印迹法检测A549细胞内G3BP1的表达情况;向A549细胞内转染以G3BP1的mRNA为靶标的小干扰RNA(siRNA)以抑制G3BP1的表达;分别检测G3BP1表达抑制后A549细胞穿过8μm聚碳酸酯膜细胞数、定向运动距离及穿过人工基底膜细胞数。结果 Western印迹法显示G3BP1在非小细胞肺癌细胞系A549中过表达;转染siRNA后72 h内提取A549细胞蛋白质,Western印迹法检测显示G3BP1表达被完全抑制;G3BP1表达抑制后A549细胞穿过8μm聚碳酸酯膜细胞数、定向运动距离及穿过人工基底膜细胞数均显著减少(P<0.05)。结论下调G3BP1表达抑制人肺癌细胞A549的体外迁移。

srGAP3在正常成年大鼠脑内的表达

目的 探讨slit roboGTP激活蛋白 3(slit roboGTPactivatedprotein 3,srGAP3)在正常成年大鼠中枢神经系统中的分布。 方法 应用免疫组织化学ABC法研究了srGAP3蛋白在正常成年大鼠脑内的分布和定位。 结果 srGAP3蛋白在正常成年大鼠脑中分布非常广泛 ,在脑内各主要结构如大脑皮质、海马、杏仁核、丘脑和下丘脑的部分核团、中脑、脑桥、小脑及延髓等均有表达。srGAP3免疫反应阳性物质位于神经元的细胞核周围。 结论 srGAP3蛋白在正常成年大鼠脑中有很广泛的表达 ,提示srGAP3蛋白在成年大鼠中枢神经系统的功能活动中可能也起重要作用。

miR-200a-3p和G3BP2表达与胃癌临床病理特征的关系

目的探究微小RNA-200a-3p(miR-200a-3p)和GTP酶激活蛋白SH3功能结合蛋白2(G3BP2)表达水平及其与胃癌临床病理特征的关系。方法选取本院收治的102例胃癌患者为研究对象,取本组所有胃癌患者的胃癌组织标本及癌旁正常组织标本。采用实时荧光定量PCR技术检测患者胃癌组织、癌旁正常组织中miR-200a-3p和G3BP2 mRNA相对表达量,收集分析胃癌患者临床病理特征,Kaplan-Meier对胃癌患者生存情况进行分析,COX回归分析影响胃癌发生的危险因素。结果胃癌组织miR-200a-3p表达水平显著低于癌旁正常组织(P <0. 05),G3BP2表达水平显著高于癌旁正常组织(P <0. 05);Pearson相关性分析表明miR-200a-3p和G3BP2 mRNA表达水平呈负相关(r=-0. 417,P <0. 05)。免疫组化结果表明胃癌组织G3BP2蛋白表达阳性率显著高于癌旁正常组织(P <0. 05)。miR-200a-3p和G3BP2表达水平与胃癌分化程度和TNM分期有关(P <0. 05)。Kaplan-Meier法分析结果显示miR-200a-3p低表达组3年生存率均显著低于高表达组(P <0. 05),G3BP2高表达组3年生存率均显著高于低表达组(P <0. 05)。COX回归分析结果显示miR-200a-3p、G3BP2表达为影响胃癌发生的独立危险因素。结论胃癌组织miR-200a-3p表达下调,G3BP2表达上调,二者表达与胃癌发生及发展有关,可作为临床评估患者预后的参考指标。

全血IQ结构域GTP酶激活蛋白3 mRNA表达对肝细胞癌的诊断价值

目的:探讨全血IQ结构域GTP酶激活蛋白3(IQGAP3)mRNA表达对肝细胞癌(HCC)的诊断价值。方法:以30例健康人为对照组,41例HCC患者为HCC组,比较2组全血IQGAP3 mRNA表达的差异。分析HCC组患者全血IQGAP3 mRNA表达与临床资料、血清甲胎蛋白(AFP)的相关性,ROC曲线分析IQGAP3 mRNA、AFP及两者联合对HCC的诊断效能。结果:HCC组全血IQGAP3 mRNA表达显著高于对照组(P<0.05)。HCC患者全血中IQGAP3 mRNA表达在不同TNM分期间存在差异(P<0.05),在年龄(P=0.645)、性别(P=0.702)、是否携带HBV表面抗原组间(P=0.147)无显著差异,与血清AFP呈正相关(r=0.713,P<0.01),IQGAP3 mRNA联合AFP的ROC曲线下面积为0.855(95%可信区间0.770~0.940),高于单独使用AFP的0.813(95%可信区间0.712~0.913)。结论:全血IQGAP3 mRNA表达对HCC有诊断价值。

人G3BP1真核表达载体的构建及其在食管癌细胞中的定位分析

目的:构建GTP酶激活蛋白SH3功能区结合蛋白1(G3BP1)的真核表达载体p EGFP-C3-G3BP1,并观察其在人食管癌EC109细胞中的表达及定位。方法:采用RT-PCR法从EC109细胞中扩增G3BP1 c DNA全长序列,用限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ双酶切PCR产物后克隆至pEGFP-C3载体,转化大肠杆菌DH5α后,挑取阳性克隆提取质粒,经双酶切及测序鉴定;将重组质粒用脂质体法转染EC109细胞,荧光定量RT-PCR和Western印迹检测G3BP1的表达,荧光显微镜观察G3BP1的定位。结果:目的基因G3BP1的序列完全正确,并在EC109细胞中获得表达,荧光显微镜观察显示G3BP1定位于细胞质。结论:构建了p EGFP-C3-G3BP1真核表达载体,并在EC109细胞中过表达,G3BP1蛋白定位于细胞质,形成应激颗粒(stress granules,SGs)。为进一步探讨G3BP1在食管癌细胞中的功能及其与SGs的相关性奠定了基础。

IQGAP3在结直肠癌组织中表达及其与患者预后的关系

目的 探讨IQ结构域GTP酶激活蛋白3(IQGAP3)在结直肠癌组织中的表达及其与患者预后的关系。方法 选取59例结直肠癌患者为研究对象。收集癌组织与癌旁正常组织,采用免疫组织化学法检测两组IQGAP3表达;同时分析IQGAP3表达与结直肠癌临床病理特征的关系;另随访3年,采用Kaplan-Meier法分析IQGAP3表达水平与结直肠癌患者预后的关系。结果 癌组织IQGAP3阳性表达率83.05%(49/59)高于癌旁正常组织33.90%(20/59),差异有统计学意义(P<0.05);IQGAP3表达与结直肠癌患者年龄、性别、体重指数(BMI)、病理分级、肿瘤直径无关(P>0.05);IQGAP3表达与肿瘤TNM分期、是否有淋巴结转移有关(P<0.05);Kaplan-Meier结果显示:IQGAP3阳性表达患者的3年生存率[30.61%(15/49)]低于阴性表达患者[70.00%(7/10)],差异有统计学意义(P<0.05)。结论 IQGAP3在结直肠癌组织内呈高表达,其表达与患者的TNM分期、是否有淋巴结转相关,且IQGAP3阳性表达患者的3年生存率更低,预后更差。

miR-105-5p在胃癌中的表达及其意义与生物学功能

目的:探讨miR-105-5p在胃癌(GC)中的表达情况、临床意义及生物学功能及其潜在的作用机制。方法:应用real-time PCR检测miR-105-5p在GC组织与癌旁组织以及不同GC细胞(MGC-803,MKN-1,SGC-7901,BGC-823和AGS)与正常胃黏膜细胞(GES-1)中的表达;分析miR-105-5p的表达与GC临床病理特征及患者预后的关系;采用Transwell迁移和侵袭实验以及MTT实验检测miR-105-5p对GC细胞迁移与侵袭能力以及增殖能力的影响;应用生物信息学工具预测miR-105-5p的下游靶点,并应用荧光素酶报告实验以及Western blot分析miR-105-5p对靶点的调节作用。结果:miR-105-5p在GC组织的表达明显高于癌旁组织,在各GC细胞中的表达均明显高于正常胃黏膜细胞(均P<0.05)。miR-105-5p的表达水平与肿瘤大小(P=0.020)和远处转移(P=0.004)明显有关;miR-105-5p低表达GC患者的总体生存率明显高于miR-105-5p高表达组的患者(P=0.001 8)。选择miR-105-5p表达量相对较低的BGC-823细胞和相对较高的MKN-1细胞,分别转染miR-105-5p模拟物和miR-105-5p抑制物,转染后结果显示,BGC-823细胞的迁移、侵袭和增殖能力明显增强,而MKN-1细胞的迁移、侵袭和增殖能力明显抑制(均P<0.05)。生物信息学分析发现,DIRAS家族GTP结合RAS样3(DIRAS3)可能是miR-105-5p的作用靶点;荧光素酶报告实验显示,miR-105-5p能够负向调节DIRAS3-3'UTR的荧光素酶活性;Western blot显示,转染miR-105-5p模拟物的BGC-823细胞中DIRAS3的表达明显下调,转染miR-105-5p抑制物的MKN-1细胞DIRAS3的表达明显上调(均P<0.05)。结论:miR-105-5p在GC中表达升高,其可能通过靶向作用于DIRAS3增强GC细胞的迁移、侵袭及增殖,进而促进GC的发生发展。

食管鳞癌G3BP和骨桥蛋白的表达及其对患者预后的影响

目的研究食管鳞癌组织中GTP酶激活蛋白SH3功能区结合蛋白（G3BP）和骨桥（OPN）蛋白的表达及其与食管鳞癌生物学行为之间的关系。方法采用免疫组织化学方法检测80例食管鳞癌组织中G3BP和OPN蛋白的表达情况，探讨它们与食管鳞癌的肿瘤大小、组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移和预后的关系。结果（1）G3BP蛋白在食管鳞癌组织中的阳性表达率为71．3％，它在淋巴结转移组的阳性表达率高于无淋巴结转移组（z=-2．283，P=0．022）；而与肿瘤大小、组织分化程度、TNM分期无关（P〉O．05）；G3BP蛋白阳性表达组患者的术后生存时间较阴性表达组短，差异有统计学意义（P=0.000）。（2）OPN蛋白在食管鳞癌组织中的阳性表达率为100％，OPN蛋白的表达水平与组织分化程度（X^2=10．766，P=0．005）及淋巴结转移（Z=2．289，P=0．022）有关，而与肿瘤大小和TNM分期无关（P〉O．05）；OPN蛋白的表达水平越高，患者术后生存时间越短（P=0.000）。（3）G3BP蛋白和OPN蛋白在食管鳞癌组织中的表达之间存在正相关性（rB=0．376，P=0．001）。结论食管鳞癌组织G3BP和OPN蛋白的表达与淋巴结转移情况及患者的预后有密切关系。

IQ结构域GTP酶激活蛋白3表达对宫颈癌细胞增殖和转移的影响

目的探讨宫颈癌组织及细胞系中IQ结构域GTP酶激活蛋白3(IQGAP3)的表达及其对宫颈癌细胞增殖、凋亡和转移的影响。方法应用免疫组化和定量PCR检测IQGAP3在宫颈癌组织及癌旁组织中的表达,利用siRNA敲低IQGAP3在宫颈癌细胞CaSki和HeLa中的表达,通过MTT法和流式细胞术分别检测IQGAP3表达对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响,通过Transwell检测IQGAP3表达对宫颈癌细胞迁移的影响,从而探讨IQGAP3在宫颈癌细胞的增殖、凋亡及迁移过程中的作用。结果 IQGAP3在宫颈癌组织及细胞中高表达,高表达IQGAP3的患者预后较差(χ~2=6. 15,P=0. 01);敲降IQGAP3在宫颈癌细胞CaSki和HeLa的表达后,宫颈癌细胞的增殖受到抑制,凋亡增加,细胞迁移减少,E-cadherin表达增加,N-cadherin表达下调(P均<0. 001)。结论 IQGAP3在宫颈癌组织中表达上调,在宫颈癌细胞增殖和转移过程中发挥重要作用; IQGAP3通过诱导上皮细胞-间充质转变(EMT),促进宫颈癌细胞的转移。

IQ结构域GTP酶激活蛋白3对HepG2细胞顺铂耐药的影响

目的探讨IQ结构域GTP酶激活蛋白3(IQ domain GTPase-activating protein 3, IQGAP3)对人肝癌HepG2细胞顺铂耐药的影响及作用机制。方法冻存HepG2细胞株,其中对照组细胞正常培养,IQGAP3组细胞转染IQGAP3,shIQGAP3组细胞转染shIQGAP3,采用Western blot法检测3组IQGAP3蛋白相对表达量。3组细胞均加入顺铂进行培养,采用MTT法检测培养第1-5天细胞存活率,采用实时荧光定量PCR法检测细胞Nanog mRNA、Oct4 mRNA、Bmi1 mRNA、c-Myc mRNA、cyclinD1 mRNA相对表达量,基因集合富集分析GO、KEGG数据库肝细胞癌样本数据中IQGAP3表达与Wnt/β-catenin通路的关系,采用Top/Fop双荧光素酶报告基因实验检测细胞β-catenin激活程度(Top/Fop比值),采用Western blot法检测细胞β-catenin核浆比例。shIQGAP3组细胞再分为shIQGAP3-氯化锂(lithium chloride, LiCl)组和shIQGAP3对照组,其中shIQGAP3对照组加入顺铂进行培养,shIQGAP3-LiCl组加入顺铂+LiCl进行培养,采用MTT法检测2组培养第1-5天细胞存活率,采用Top/Fop双荧光素酶报告基因实验检测细胞β-catenin激活程度(Top/Fop比值)。结果 IQGAP3组细胞IQGAP3蛋白相对表达量(9.13±0.42)均高于对照组(1.08±0.25)和shIQGAP3组(0.42±0.07)(P<0.05),对照组高于shIQGAP3组(P<0.05)。培养第3-5天,IQGAP3组细胞存活率均高于对照组和shIQGAP3组(P<0.05),对照组高于shIQGAP3组(P<0.05);培养第1-5天,IQGAP3组、shIQGAP3组、对照组细胞存活率均依次降低(P<0.05)。IQGAP3组细胞Nanog mRNA、Oct4 mRNA、Bmi1 mRNA、c-Myc mRNA、cyclinD1 mRNA相对表达量均高于对照组和shIQGAP3组(P<0.05),对照组高于shIQGAP3组(P<0.05)。GO、KEGG数据库肝细胞癌样本数据分析结果显示,活化的Wnt/β-catenin信号通路在IQGAP3表达上调的样本中富集(富集分数=0.497,P<0.001;富集分数=0.527,P<0.001);IQGAP3组细胞β-catenin核浆比例(3.61±0.24)和Top/Fop比值(2.61±0.29)均高于对照组(0.98±0.14、1.13±0.08)和shIQGAP3组(0.25±0.03、0.57±0.13)(P<0.05),对照组高于shIQGAP3组(P<0.05)。shIQGAP3-LiCl组细胞Top/Fop比值(3.18±0.33)高于shIQGAP3对照组(1.02±0.06)(P<0.05);培养第4-5天,shIQGAP3-LiCl组细胞存活率高于shIQGAP3对照组(P<0.05);培养第0-5天,shIQGAP3-LiCl组、shIQGAP3对照组细胞存活率均依次降低(P<0.05)。结论 IQGAP3可能通过激活Wnt/β-catenin通路增加肿瘤干性基因表达,促进HepG2细胞对顺铂耐药。

微小RNA-329靶向三磷酸鸟苷酶激活蛋白SH3功能区结合蛋白1抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭

目的筛选骨肉瘤相关的微小RNA(miRNA,miR),研究其对骨肉瘤细胞的影响及其机制。方法生物信息学筛选GSE39058中骨肉瘤相关miRNA的表达差异,确定miR-329为研究目标。细胞计数试剂盒(CCK-8)分析miR-329对骨肉瘤143B细胞增殖能力的影响,Transwel比较miR-329对骨肉瘤143B细胞侵袭能力的影响。双荧光素酶报告基因实验观察miR-329对G3BP1的调控作用。蛋白质印迹法(Western blot)分析miR-329转染前后G3BP1、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)的表达水平。组间比较采用t检验。结果获得差异miRNA 90个,其中miR-329功能富集程度较高。聚合酶链反应(PCR)结果表明miR-329在各骨肉瘤细胞中的表达低于成骨细胞hFOB1.19(P<0.05)。CCK-8结果显示miR-329模拟物组143B细胞增殖率较对照组NC低(0.571±0.019比0.975±0.022,P<0.05),差异有统计学意义。Transwell分析发现转染miR-329模拟物组侵袭细胞数明显少于对照组[(28.83±4.55)个比(58.17±6.25)个,t=6.220,P<0.05],差异有统计学意义。双荧光素酶报告基因分析结果显示共转染G3BP1 mRNA3’端非编码区(3’UTR)wt和miR-329质粒的细胞荧光素酶相对活性较对照组显著降低(0.45±0.06比1.01±0.09,t=1.250,P<0.05),差异有统计学意义。Western blot结果表明转染miR-329 mimic后E-cadherin表达水平高于对照组(0.51±0.11比0.31±0.12,t=2.903,P<0.05),而Vimentin、N-cadherin表达量低于对照组(0.13±0.03比0.25±0.06,t=2.859,P<0.05;0.28±0.11比0.45±0.12,t=2.574,P<0.05),差异有统计学意义。结论miR-329通过靶向抑制G3BP1表达,抑制肿瘤细胞的上皮-间充质转化,从而抑制骨肉瘤143B细胞的体外增殖和侵袭。