莱菔硫烷诱导HepG-2细胞G_2/M期阻滞及其对Cdk1和CyclinB1蛋白表达的影响

目的:研究莱菔硫烷(SFN)在体外对人肝癌HepG-2细胞G2/M期的阻滞作用,并探讨其分子作用机制。方法:10、20、40μmol·L-1的SFN处理体外培养的HepG-2细胞株48h后,采用流式细胞仪检测SFN对HepG2细胞周期的影响;WesternBlot法检测SFN对HepG2细胞内Cdk1、p-Cdk1(Thr14)和CyclinB1蛋白表达的影响。结果:SFN作用于HepG-2细胞48h后,随着SFN浓度的增大,G2/M期细胞比例逐渐升高,当SFN浓度达到40μmol·L-1时,G2/M期细胞比例达到31.95%,且出现凋亡峰;随SFN浓度的增大,细胞内Cdk1和CyclinB1蛋白的表达量显著降低(P<0.01或P<0.05),同时p-Cdk1(Thr14)的表达显著升高(P<0.01或P<0.05)。结论:SFN可诱导人肝癌HepG-2细胞发生G2/M期阻滞;SFN可通过下调HepG-2细胞内Cdk1和CyclinB1蛋白的表达、上调p-Cdk1(Thr14)的蛋白表达水平,进而抑制Cdk1-CyclinB1复合物的形成和活化使人肝癌HepG-2细胞阻滞在G2/M期。

莱菔硫烷诱导急性髓系白血病KG1a和KG1细胞G_(2)/M期阻滞的作用和相关机制

目的:研究莱菔硫烷(sulforaphane,SFN)对急性髓系白血病细胞G_(2)/M期阻滞的作用和相关机制。方法:不同浓度的SFN作用KG1a和KG1细胞48 h后,流式细胞术检测细胞周期的变化,利用高通量转录组测序技术检测SFN对KG1a细胞周期相关基因表达情况的影响;采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测P53、P21、CDC2、CyclinB1的mRNA表达。采用Western blot检测P53、CDC2、P-CDC2和CyclinB1的蛋白表达。结果:经SFN作用48 h后,KG1a和KG1细胞的G_(2)/M期细胞明显增多,当SFN浓度为8μmol/L时,KG1a细胞在G_(2)/M期从11.9%上升至54.0%,KG1细胞从18.5%上升至83.3%(P <0.001)。SFN作用KG1a细胞后,KEGG通路分析结果显示,差异表达基因显著富集P53信号通路。热图结果显示,P53和P21基因表达上调,CDC2基因表达下调。KG1a和KG1细胞经SFN作用后,p53和P21的mRNA水平均出现上调(P <0.05或P <0.01)。随着SFN剂量的上升,CDC2的mRNA水平呈下调趋势,当SFN为8μmol/L时,CDC2的mRNA表达水平显著低于对照组(P <0.05)。经SFN作用KG1a和KG1后,p53的蛋白水平出现上调,SFN 8和12μmol/L浓度组均高于对照组,差异有统计学意义(P <0.05)。两组细胞经SFN作用后CDC2的蛋白水平均明显下降,且呈浓度依赖趋势(r=0.9482和r=0.8977),SFN8和12μmol/L浓度组CDC2蛋白水平均明显低于对照组(P <0.05或P <0.01),P-CDC2蛋白表达水平上调。CyclinB1的蛋白和mRNA表达水平一致,变化不明显。结论:SFN可能通过激活P53信号通路,进一步抑制CDC2表达和CDC2/CyclinB1复合物的活性,诱导急性髓系白血病KG1a和KG1细胞阻滞在G_(2)/M期。

二烯丙基二硫通过磷酸化Chk1负调控Cdc25C/CyclinB1/CDK1通路阻滞白血病K562细胞G_(2)/M期

目的:研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人白血病K562细胞周期阻滞及其分子机制。方法:采用CCK-8、细胞计数及流式细胞术观察DADS对K562细胞增殖与周期阻滞效应。Western Blot检测DADS对K562细胞PCNA、Chk1/2以及下游分子Cdc25C、CyclinB1与CDK1表达的影响。结果:CCK-8检测显示,15μmol/L、30μmol/L、60μmol/L、120μmol/L、240μmol/L DADS处理后,呈浓度依赖性抑制K562细胞增殖,抑制率分别为32.48%、59.34%、66.42%、77.06%、81.05%(P<0.05)。对照组与Tween80组无抑制作用(P>0.05)。细胞计数结果显示,30μmol/L、60μmol/L与120μmol/L DADS处理K562细胞后,群体倍增时间分别为22.71±0.29、36.69±0.93与73.02±0.87呈浓度依赖性增加(P<0.05),而Tween80组与对照组无明显差异(P>0.05)。流式细胞术检测显示,60μmol/L与120μmol/L DADS作用K562细胞24 h与48 h后,G_(2)/M期百分率分别增加到17.6%与28.5%和18.6%与34.4%,较对照组有显著性差异(P<0.05)。60μmol/L DADS作用K562细胞1 h、2 h、4 h、8 h和24 h后,PCNA表达呈时间依赖性表达下调(P<0.05)。p-Chk1表达呈时间依赖性上调(P<0.05),而Chk1、Chk2与p-Chk2表达无明显差异(P>0.05)。并且,Cdc25C、CyclinB1和CDK1分别呈时间依赖性下调(P<0.05),但是,14-3-3蛋白无明显改变(P>0.05)。结论:DADS可磷酸化Chk1通过Cdc25C/CyclinB1/CDK1通路抑制K562细胞增殖与阻滞G_(2)/M期。

汉防己甲素对人鼻咽癌CNE1和CNE2细胞株的放疗增敏作用

目的:探讨最大非毒性剂量汉防己甲素(tetrandrine,Tet)对人鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2的放疗增敏机制。方法:分别采用最大非毒性剂量Tet(对CNE1细胞为1.5μmol/L;对CNE2细胞为1.8μmol/L)、4 Gy放疗和最大非毒性剂量Tet联合放疗处理CNE1和CNE2细胞;流式细胞术检测各组细胞周期分布,Western blot检测各组细胞γ-H2AX、cleaved caspase-3、p-CDC25C、CDK1、p-CDK1、cyclin B1、ERK和p-ERK的蛋白水平。结果:最大非毒性剂量Tet联合放疗后可上调CNE1和CNE2细胞中γ-H2AX的表达。放疗组CNE1和CNE2细胞G_2/M期的比例分别为(18.09±0.42)%和(18.48±1.32)%,联合处理组CNE1和CNE2细胞G_2/M期的比例降为(15.88±1.04)%和(13.80±0.82)%,与放疗组比较差异有统计学意义(P<0.05)。联合处理可增加放疗所致的cleaved caspase-3的蛋白水平(P<0.05)。不同浓度Tet处理CNE1和CNE2细胞后,p-CDC25C和p-CDK1的蛋白水平随Tet浓度增加而升高(P<0.05),CDK1的表达无明显改变;最大非毒性剂量Tet不影响p-CDC25C、p-CDK1和CDK1的蛋白水平。在CNE1和CNE2细胞中,联合处理可明显降低放疗引起的p-CDC25C和p-CDK1的蛋白水平(P<0.05),上调放疗后cyclin B1的表达,而对总CDK1的表达无明显调节作用;联合处理可显著抑制放疗所致的pERK蛋白水平(P<0.05)。结论:最大非毒性剂量Tet可以增加放疗引起的CNE1和CNE2细胞的DNA断裂及细胞凋亡,其放疗增敏的机制可能与Tet调控ERK/CDC25C/CDK1/cyclin B1通路、去除放疗导致的G2/M期阻滞有关。

冷休克对PG、HeLa细胞周期调控及p21WAF1/cip1蛋白表达的影响

目的 研究冷休克对p5 3基因突变的PG细胞、p5 3野生型的HeLa细胞的周期调控及 p2 1WAF1/cip1蛋白表达的影响。方法 将PG、HeLa细胞置 4℃冷冻 4h ,使细胞发生冷休克 ,用流式细胞仪分析细胞DNA含量及凋亡细胞百分率 ,Westernblot检测 p2 1WAF/cip1蛋白的表达。 结果 冷休克诱导PG、HeLa细胞发生G2 /M期周期阻滞及凋亡 ,p2 1WAF/cip1蛋白表达增高 (PG以 12h、HeLa以 18h最为显著 )。冷休克诱导PG、HeLa细胞发生G2 /M期周期阻滞及凋亡与 p2 1WAF/cip1蛋白表达增高同步。结论 冷休克诱导PG、HeLa细胞发生G2 /M期阻滞及凋亡、p2 1WAF/cip1表达的增高与细胞的 p5 3状态无关。

二烯丙基二硫对人白血病细胞HL-60增殖、细胞周期及p21表达的影响

目的观察二烯丙基二硫(DADS)作用于人白血病细胞系HL-60后,细胞增殖、细胞周期及细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白p21表达的变化,探讨DADS抑制HL-60增殖、诱导G2/M阻滞的作用机制。方法不同浓度DADS作用HL-60后,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期,Westernblot检测p21蛋白水平。结果在一定浓度范围之内,DADS能抑制HL-60细胞增殖,细胞周期发生G2/M期阻滞,并上调p21蛋白水平。结论DADS能通过上调p21的表达而抑制HL-60增殖,诱导其G2/M期阻滞。

硼替佐米联合PLK1抑制剂处理肿瘤细胞A549、HeLa对其增殖影响

目的明确硼替佐米(bortezomib,PS341)和PLK1抑制剂处理肿瘤细胞HeLa、A549后细胞增殖的变化,探索不同药物组合使用的抗肿瘤作用机制。方法CCK-8法检测不同浓度分组的药物处理A549、HeLa细胞后的生长曲线;采用PI染色法检测PLK1抑制剂BI2536、GW843682X与蛋白酶体抑制剂PS341的合并使用对肿瘤细胞周期的影响;采用Western blot检测细胞周期相关蛋白和PLK1的蛋白表达水平。结果PLK1抑制剂BI2536、GW843682X均明显抑制A549、HeLa细胞生长并使其阻滞在G_(2)/M期,加入蛋白酶体抑制剂PS341后细胞增殖抑制被削弱、G_(2)/M期阻滞的细胞减少、周期蛋白cyclin E1异常积累。结论PS341可明显减弱PLK1抑制剂的细胞增殖抑制效果,认为PLK1抑制剂与PS341联合使用需考虑药效减弱的风险,推测相关分子机制涉及细胞周期蛋白代谢异常。

Anti-proliferative and apoptotic effects of S1,a tetrandrine derivative,in human gastric cancer BGC-823 cells

The aim of the study was to investigate the anti-proliferation and apoptosis-inducing effects of S1, a novel tetrandrine derivative, in human gastric cancer BGC-823 cells and explore the possible mechanism of action. The anti-proliferative activity was determined by MTT assay; the induction of cell cycle arrest and apoptosis were detected by flow cytometry. Quantitative real time RT-PCR and Western blotting were used to evaluate the m RNA and protein expression levels in mitochondrial pathway. S1 significantly reduced cell viability and induced a G2/M phase arrest and apoptosis in dose- and time-dependent manner. Further studies showed that S1 increased m RNA and protein expression of Bax and the Bax/Bcl-2 ratio. Moreover, S1 decreased the protein expression of procaspase-9 and procaspase-3, suggesting that the induction of apoptosis may be related to the alteration of the ratio of Bax/Bcl-2 and the activation of caspases. These findings suggested that S1 merits further investigation as a novel therapeutic agent for the treatment of human gastric cancer.

人肝细胞氧化应激模型中热休克蛋白90α对细胞周期蛋白B1的降解调控机制研究

目的 观察人肝细胞(L02)氧化应激模型中热休克蛋白90α(heat shock protein 90α, Hsp90α)和相关底物蛋白细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)的蛋白水平变化,以及Hsp90α表达下调后对Cyclin B1表达的影响,明确Hsp90α对Cyclin B1功能的影响,为氧化应激相关的肝脏疾病防治提供新思路。方法 以200μM H_(2)O_(2)建立氧化应激L02细胞损伤模型;通过CCK-8法观察氧化应激对细胞存活的影响,比色法测定细胞内谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量,流式细胞术检测细胞周期,免疫印迹法检测氧化应激对细胞内Hsp90α及Cyclin B1蛋白水平的影响。结果 随着氧化应激刺激时间的延长,GSH含量逐渐减少,抗氧化能力不断降低。从6 h开始,胞内GSH水平较对照组明显下降(均P<0.05);H_(2)O_(2)对L02细胞增殖的抑制程度增强;氧化应激后细胞周期检测点G2/M期阻滞明显;氧化应激导致胞内Hsp90α蛋白水平先增加后降低,在刺激24 h时Hsp90α表达出现明显下降,Cyclin B1蛋白水平则在24 h明显增加,与对照组相比,差异有统计学意义(均P<0.05)。结论 氧化应激可动态影响细胞内Hsp90α及CyclinB1蛋白表达水平;氧化应激下,Hsp90α表达降低可影响与G2/M期调节有关的底物蛋白Cyclin B1水平,Hsp90α对Cyclin B1功能维持起保护性作用。