青蒿琥酯通过调控GADD45A、NACC1的表达抑制肝癌细胞的作用

目的阐明青蒿琥酯(artesunate,ART)在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)病理进程中对肿瘤细胞的作用及潜在的机制。方法用含不同浓度ART的培养基处理两种HCC细胞系MHCC-97H、HCC-LM3,以0 mg·L-1 ART处理的细胞作为对照组,对比ART对HCC的作用。采用MTT和克隆形成实验测定ART对HCC细胞生长能力的影响;划痕实验和Transwell实验分别检测ART对HCC细胞迁移和侵袭能力的影响;流式细胞术验证ART对HCC细胞凋亡和细胞周期变化的影响;通过转录组测序分析以及qRT-PCR验证关键基因的表达情况探究ART在HCC细胞中的可能作用机制。结果与对照组相比,ART处理后的肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力明显降低(P<0.01),而细胞凋亡率明显上升,且G_(2)/M期细胞比例明显增高,提示肿瘤细胞被阻滞于该期。使用RNA测序数据进行转录组学分析,确定生长停滞与DNA损伤诱导蛋白45A(growth arrest and DNA damage inducible alpha,GADD45A)是ART的潜在作用靶点,并且提示,ART可通过上调GADD45A的表达进而诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞。此外,生信分析结果提示,GADD45A与其上游转录因子伏隔核相关蛋白1(nucleus accumbens associated 1,NACC1)有蛋白互作现象,并且经ART处理后,GADD45A与NACC1的mRNA水平和蛋白水平均发生明显变化。结论ART可能通过影响GADD45A及其潜在上游NACC1基因的表达抑制HCC的发生发展。通过探究ART作用于HCC的功能影响及发生机制,为临床治疗肝癌提供新药物、新方向和新思路。

异丙酚通过miR-133a-3p/FTL轴调控GADD45A/JNK通路影响胃癌细胞增殖、迁移及凋亡

目的:探讨异丙酚是否通过miR-133a-3p/FTL轴调控GADD45A/JNK通路影响胃癌细胞的增殖、迁移及凋亡。方法:将胃癌MKN-28细胞系分为磷酸盐缓冲液(PBS)组、异丙酚组、miR-NC组、miR-133a-3p mimics组、anti-miR-NC组、anti-miR-133a-3p组、si-NC组、si-FTL组、异丙酚+anti-miR-NC+si-NC组、PBS+anti-miR-NC+si-NC组、异丙酚+anti-miR-133a-3p+si-NC组、异丙酚+anti-miR-133a-3p+si-FTL组。应用RT-qPCR检测miR-133a-3p和铁蛋白轻链(FTL)mRNA的表达水平;应用MTT法与克隆形成实验测细胞增殖;应用流式细胞术、蛋白质印迹法分别检测细胞凋亡及蛋白表达水平;应用双荧光素酶报告实验检测miR-133a-3p与FTL的靶向关系;应用划痕实验与Transwell侵袭实验检测细胞迁移和侵袭。结果:与PBS组比较,异丙酚组细胞活性、划痕愈合率、细胞克隆形成数、迁移、侵袭细胞数均减少(P<0.05);细胞凋亡率、p53、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、miR-133a-3p、GADD45A及p-JNK蛋白表达水平均升高(P<0.05),FTL表达水平降低(P<0.05)。双荧光素酶实验结果显示,miR-133a-3p靶向调控FTL。敲低FTL或过表达miR-133a-3p后,细胞凋亡率升高,细胞活性、划痕愈合率、细胞克隆形成数、迁移和侵袭细胞数降低;细胞中GADD45A、p-JNK、p53、Bax表达水平升高(P<0.05)。敲低FTL逆转了使用异丙酚及抑制miR-133a-3p表达对GADD45A/JNK信号通路以及MKN-28细胞恶性生物学行为的影响。结论:异丙酚可能通过miR-133a-3p/FTL轴调控GADD45A/JNK通路继而抑制胃癌细胞增殖、迁移,并促进细胞凋亡。

氟氯氰菊酯通过GADD45B介导JNK/p38MAPK通路对大鼠肾脏损伤的影响

目的 探讨氟氯氰菊酯暴露通过影响生长停滞和DNA损伤诱导β(GADD45B)水平并介导JNK/p38MAPK通路对大鼠肾脏损伤的影响。方法 将40只SPF级Wistar雄性大鼠按随机数表法分为4组,即对照组、氟氯氰菊酯低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组10只。隔天灌胃连续染毒28 d,取肾脏组织称量后计算脏器系数。HE染色光镜下观察大鼠肾脏组织病理形态变化;透射电镜观察肾脏细胞超微结构变化;应用试剂盒检测肾脏组织中氧化损伤指标超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量变化;应用Western blot、qPCR检测GADD45B、p38MAPK、p-p38MAPK、JNK、p-JNK mRNA及蛋白表达水平变化。结果 与对照组相比,氟氯氰菊酯染毒大鼠体质量增长、肾脏质量和脏器系数的差异均无统计学意义(P均>0.05);HE染色结果显示:与对照组相比,随着氟氯氰菊酯染毒剂量的增加,肾小管肿胀越发明显,肾小管上皮细胞大量脱落,肾小球萎缩。透射电镜结果显示:与对照组相比,随着氟氯氰菊酯染毒剂量的增加,基底膜逐渐增厚,线粒体和内质网出现不同程度损伤。与对照组比较,低、中、高剂量组MDA含量均升高(P均<0.05)、SOD活力均降低(P均<0.05)。与对照组相比,氟氯氰菊酯低、中、高剂量组中GADD45B的mRNA表达水平均升高(P均<0.05);JNK和p38MAPK的mRNA表达水平均降低(P均<0.05)。Western blot结果显示,与对照组比较,氟氯氰菊酯低、中、高剂量组中GADD45B、p-JNK、p-p38的蛋白表达水平均升高(P均<0.05);JNK和p38的蛋白表达水平均降低(P均<0.05)。结论 在氟氯氰菊酯致大鼠肾脏损伤中,GADD45B可通过激活JNK/p38MAPK通路诱导大鼠肾脏损伤。

GADD45A通过端粒替代延长途径调控骨肉瘤细胞增殖

目的:探讨GADD45A对骨肉瘤细胞的增殖和端粒调控功能。方法:应用siRNA和shRNA处理骨肉瘤细胞U2OS,观察骨肉瘤细胞增殖、端粒功能和端粒延长替代途径的变化。qPCR检测GADD45A敲低后mRNA水平。CCK-8实验和克隆形成实验检测骨肉瘤细胞增殖情况。细胞中期分裂相-荧光原位杂交实验检测端粒功能变化。免疫荧光-荧光原位杂交实验和C-circle实验检测端粒损伤情况和端粒延长替代途径相关表型。结果:qPCR结果表明,siRNA敲低GADD45A后mRNA水平降低(t=25.96,P<0.0001);shGADD45A-1和shGADD45A-2 GADD45A的mRNA水平降低(t=21.12、18.37,均P<0.0001)。对应的CCK-8(t=5.051、6.192、3.775、14.86、22.93、3.013、14.61、20.93,均P<0.05)和克隆形成实验(t=46.68、23.73、24.98,均P<0.0001)结果表明,敲低GADD45A抑制了骨肉瘤细胞增殖。细胞中期分裂相-荧光原位杂交实验结果显示,GADD45A缺失会加重端粒多信号(t=24.04、7.243、27.93,均P<0.01)和端粒信号缺失现象(t=8.222、16.61、6.781,均P<0.01)。免疫荧光-荧光原位杂交实验结果表明,siRNA敲低GADD45A后H2AX组蛋白变体和早幼粒细胞白血病体与端粒的共定位增加(t=19.16、10.65,均P<0.0001);shGADD45A-1、shGADD45A-2也证实了H2AX组蛋白变体和早幼粒细胞白血病体与端粒共定位的比例升高(t=14.71、24.03、16.69、18.10,均P<0.0001)。C-circle实验结果表明,siRNA敲低GADD45A以及shGADD45A-1和shGADD45A-2两细胞系中染色体外端粒DNA环C-circle水平升高(t=41.27、14.06、4.539,均P<0.05)。结论:GADD45A调控端粒延长替代途径、保护端粒功能并促进骨肉瘤细胞增殖。

^(60)Coγ射线照射淋巴细胞诱导PIG3和GADD45基因mRNA变化

用^(60)Coγ射线照射正常人外周血永生化淋巴细胞系后,初步分析受照细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平的改变状况,并探讨上述基因作为辐射生物剂量计的可能性及意义。用^(60)Coγ射线照射淋巴细胞,采用不同剂量(0～10Gy)照射和照射后不同时间点(0～72h)收集细胞,抽提mRNA,用Real-time PCR检测细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平的变化。结果表明,正常人外周血永生化淋巴细胞系中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平随照射剂量的增高而增加,并呈现出剂量效应关系。5Gy剂量^(60)Coγ射线照射后,淋巴细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平随时间的推移不断增高,在8h时均达到最高,随后开始降低。PIG3和GADD45基因对辐射均较敏感,其表达具有良好的剂量效应和时间效应关系,但相比而言,PIG3的表达随照射剂量和照射后时间的变化更加显著,更有潜力作为生物剂量计以满足实际需要。

Gadd45介导抑癌基因BRCA1诱导的G_2/M期阻滞

背景与目的:目前已经肯定,抑癌基因BRCA1是细胞周期监测点调控的重要因子,但BRCA1在细胞周期阻滞中的作用机制尚不完全清楚。本研究的目的是探讨Gadd45在BRCA1诱导的细胞周期阻滞中所起的作用。方法:应用转染、流式细胞仪细胞筛选(分选)、Westernblot检测分析BRCA1诱导Gadd45的表达;利用CAT酶活性测定的方法检测外源BRCA1对Gadd45启动子所起作用;以流式细胞周期分析方法检测反义Gadd45转染对BRCA1诱导的细胞G2/M期阻滞的影响;采用细胞生长集落形成分析反义Gadd45转染HeLa、HCT116细胞在BRCA1诱导的细胞生长抑制过程所起的作用。结果:外源转染BRCA1可诱导Gadd45蛋白的表达;BRCA1激活Gadd45启动子的转录;反义Gadd45可显著阻遏BRCA1诱导细胞G2/M期阻滞;反义Gadd45转染可明显降低BRCA1对HeLa、HCT116细胞集落形成的抑制作用。结论:Gadd45作为BRCA1的下游调控基因,在BRCA1诱导的细胞G2/M期阻滞过程和生长抑制中起介导作用。

低聚壳聚糖与银杏叶聚戊烯醇配伍对辐射损伤小鼠微核率及p53、Gadd45蛋白表达的影响

以低聚壳聚糖与不同浓度的银杏叶聚戊烯醇配伍,研究了其对受照小鼠30天存活率、存活时间、骨髓微核及脾脏p53、Gadd45蛋白的影响。结果表明,300 mg/kg低聚壳聚糖与5 mg/mg银杏叶聚戊烯醇配伍后能有效提高辐射损伤动物存活率和存活时间,降低损伤动物的微核率以及p53、Gadd45蛋白表达。说明低聚壳聚糖与银杏叶聚戊烯醇配伍具有一定的辐射损伤保护作用。

Gadd45a在抑制细胞转化和肿瘤恶性进展中的作用

Gadd45a,一个受p53和BRCA1调节的生长阻滞和DNA损伤基因,在抑制细胞转化和肿瘤恶性进展中扮演重要的角色.Gadd45a可以通过抑制细胞生长以及促进DNA损伤修复等间接或者直接方式维持基因组稳定性,从而抑制细胞转化和肿瘤的恶性进展.此外,Gadd45a还可通过对一些信号传导通路的调节,参与肿瘤发生发展的抑制.

海风藤酮对老龄大鼠局灶性脑缺血DNA损伤修复相关基因GADD45表达的影响

目的:观察老龄大鼠局灶性脑缺血后DNA损伤修复相关基因GADD45表达的规律,探讨海风藤酮对神经细胞凋亡及GADD45表达的影响。方法:采用26月龄Wistar大鼠,经光化学诱导局灶性脑缺血后应用海风藤酮进行干预,观察不同时间和空间状态下GADD45蛋白表达的改变,同时运用TUNEL染色观察神经细胞的凋亡现象。结果:缺血4h组,在缺血中心区可见少许GADD45反应阳性细胞,而缺血周边区GADD45反应阳性细胞大量表达,较对照组差异有统计学意义(P<0.05)。缺血24h组,周边区GADD45表达较缺血4h有所降低,但仍高于假手术组(P<0.05),至缺血5d时,周边区GADD45表达较假手术组无明显差异。海风藤酮治疗组,缺血周边区TUNEL阳性细胞数较假手术组增多(P<0.05),但较对照组减少(P<0.05),而GADD45表达阳性细胞数较对照组增多(P<0.05),与假手术组比较增多(P<0.01)。结论:海风藤酮可有效保护缺血神经细胞,同时可以上调DNA修复基因GADD45的表达,减小DNA损伤的程度。

p53和Gadd45a蛋白在胰腺癌组织中的表达及临床病理学意义

目的探讨胰腺浸润性导管癌(IDC)组织中p53和Gadd45a蛋白表达及临床病理学意义。方法采用免疫组织化学方法检测59例胰腺IDC标本中p53和Gadd45a蛋白的表达情况,分析其与临床病理学参数之间的关系。结果p53蛋白表达阳性率为67.8%(40/59),Gadd45a蛋白为42.4%(25/59)。<65岁胰腺IDC患者的p53蛋白表达阳性率明显高于≥65岁者(χ2=4.711,P=0.030),Gadd45a蛋白表达则与患者年龄无关。不同组织学分化程度和不同TNM分期癌组织中p53蛋白表达差异无显著性;不同TNM分期癌组织中Gadd45a蛋白表达差异无显著性,但不同组织学分化程度癌组织中则差异有显著性(χ2=10.052,P=0.007)。p53(+)组和Gadd45a(+)组中位生存时间分别短于p53(-)组和Gadd45a(-)组(χ2=0.09,P=0.764;χ2=0.14,P=0.704)。结论p53和Gadd45a在胰腺癌组织中均有较高表达。p53和Gadd45a蛋白的过表达可能与胰腺癌的恶性生物学行为有关。两者单独或联合表达与胰腺癌患者的预后无关。

p53与Gadd45a蛋白在胃癌组织中的表达及临床病理学意义

目的近年来研究表明,p53与Gadd45a蛋白在胃癌的发生、发展过程中发挥重要作用。文中将探讨胃癌组织中p53与Gadd45a蛋白表达及临床病理学意义。方法采用免疫组织化学方法检测101例胃癌及其癌旁组织中p53与Gadd45a蛋白的表达情况,分析其与临床病理学参数之间的关系。结果胃癌及癌旁组织中p53蛋白表达的阳性率分别为67.33%、12.97%,Gadd45a蛋白表达的阳性率分别为33.79%、79.18%。与癌旁组织中的表达相比,p53蛋白在癌组织中的表达增强,而Gadd45a蛋白的表达却减弱,差异有统计学意义(P<0.05)。不同组织学分化程度、淋巴结转移转移情况及不同TNM分期癌组织中p53与Gadd45a蛋白的表达差异有统计学意义(P<0.05)。结论 p53与Gadd45a蛋白表达的变化在胃癌的发生发展中起到重要作用。两者的过表达可能与胃癌的恶性生物学行为有关。

食管鳞癌组织中Gadd45G基因家族的表达及其临床意义

目的:观察生长阻滞和DNA损伤诱导基因(growth arrest and DNA-damage-inducible 45,Gadd45)家族在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中的表达,并探讨其临床意义。方法:选取河北医科大学第四医院2004-2008年间食管鳞癌患者128例的癌组织和癌旁组织标本。RT-PCR检测Gadd45家族Gadd45A、Gadd45B和Gadd45G mRNA在食管鳞癌组织及癌旁组织中的表达,免疫组织化学方法检测Gadd45A、Gadd45B和Gadd45G蛋白在食管鳞癌组织及癌旁正常组织中的表达情况,分析Gadd45A、Gadd45B和Gadd45G表达与食管鳞状细胞癌的临床病理特征和预后之间的关系。结果:与癌旁组织相比,食管鳞癌组织中Gadd45A mRNA表达水平显著升高[(0.8924±0.3457)vs(0.6123±0.2132),P<0.05];Gadd45B mRNA表达水平没有显著变化[(0.8256±0.3110)vs(0.8173±0.3069),P>0.05];Gadd45G mRNA表达水平显著降低[(0.3855±0.1210)vs(0.8214±0.3069),P<0.05],癌组织中Gadd45G mRNA表达与TNM分期和组织学分化程度密切相关。Gadd45A在癌旁组织中的蛋白表达以细胞核着色为主,而在部分肿瘤组织中表现为细胞质表达模式。与癌旁组织相比,食管鳞癌组织中Gadd45A的表达显著升高(χ2=55.603,P=0.000);Gadd45B的表达没有显著性差异(χ2=0.456,P=0.500);Gadd45G的表达显著降低(χ2=70.134,P=0.000)。Ⅲ期和Ⅳ期食管鳞癌患者Gadd45G蛋白表达水平显著低于Ⅰ期和Ⅱ期患者(χ2=5.768,P=0.016),低分化组的Gadd45G蛋白阳性表达率显著低于中高分化组(χ2=4.483,P=0.034)。Gadd45G阳性患者的5年存活率明显高于阴性患者(44%vs 21%,P<0.05);Cox模型分析显示,Gadd45G蛋白的表达是食管鳞癌患者的一个独立预后因素。结论:Gadd45 A和Gadd45 G基因在食管鳞癌中的异常表达可能参与了食管鳞癌的发生、发展。

DNA损伤修复相关基因Gadd45的研究进展

生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45(growth arrest and DNA damage inducible protein 45,Gadd45)基因家族属p53、BRCA1的下游基因,拥有Gadd45α、Gadd45β和Gadd45γ3个成员,其中Gadd45α可由多种损伤因素快速诱导产生,受p53和BRCA1的调节,在调控G2/M细胞周期监测点与维持基因组稳定性中起重要作用,从而抑制细胞转化和肿瘤的恶性进展。Gadd45β主要通过调控p53和JNK来抑制细胞生长及细胞凋亡的过程。Gadd45γ在基因损伤因子,如电离辐射、紫外线等诱导下而表达上调,受p53基因的调控,通过与MEKK4相互作用,在JNK和P38相关的凋亡途径中起作用,即通过细胞周期阻滞和细胞凋亡对细胞生长发挥负向调控,具有抑制细胞增殖和促进凋亡的作用。Gadd45基因不仅与细胞生存和凋亡有关,还参与细胞转化和肿瘤形成,但在不同的细胞状态下发挥不同甚至相反的作用。

Gadd45a和p53在乳腺癌中的表达及临床病理意义

目的:探讨Gadd45a和p53在乳腺癌中的表达情况及其与临床病理参数和预后的关系。方法:采用免疫组化法检测78例乳腺癌组织及其癌旁正常组织中Gadd45a和p53的表达。结果:Gadd45a在乳腺癌组织中的阳性表达率为38.4%,明显低于正常乳腺组织,p53在乳腺癌组织中的阳性表达率为65.4%,明显高于正常乳腺组织,差异均具有统计意义(P<0.05);Gadd45a在乳腺癌组织学Ⅰ级组、Ⅱ级组、Ⅲ级组的阳性表达率依次下降,差异均有统计学意义(P<0.05);p53在伴有淋巴结转移组中的阳性表达率高于无淋巴结转移组,差异均有统计意义(P<0.05);p53表达与Gadd45a表达呈负相关(P<0.05);Gadd45a阳性组的生存期长于阴性组,生存率高于阴性组,存在统计学差异;p53阳性组的生存期短于阴性组,生存率低于阴性组,存在统计学差异(P<0.05);p53(+)Gadd45a(-)组(即阳性组)中位生存时间短于阴性组,生存率低于阴性组。结论:Gadd45a和p53蛋白的检测可作为乳腺癌恶性程度的检测指标;p53的表达与乳腺癌的转移相关,Gadd45a的表达与乳腺癌的分化分级相关;p53高表达及Gadd45a低表达与乳腺癌的不良预后相关;p53(+)Gadd45a(-)表型与乳腺癌的不良预后相关;Gadd45a蛋白有望成为乳腺癌治疗的新的靶点。

GADD45α对大鼠部分肝切除后肝脏再生的调控作用

目的探讨生长阻滞和DNA损伤诱导基因GADD45α在大鼠部分肝切除（PH）后肝再生中的作用及其调节机制。方法将114只大鼠随机分为19组,2/3肝切除9组,手术对照9组,正常对照1组,制作大鼠部分肝切除模型,然后用大鼠基因组芯片Rat Genome 230 2.0检测部分肝切除后再生肝的基因表达变化,采用实时定量PCR技术验证芯片检测结果。利用谱函数（Ep）分析基因表达变化预示的生理活动改变,进而通过Ingenuity Pathway Analysis（IPA）汇总GADD45α调控肝再生的信号通路并分析其可能的分子机制。结果 GADD45α在PH后2~6h、24h和36~72h均表达上调,GADD45α通过NF-κB、p38PRAK、p53、STAT3-p21、STAT3-Bcl-2、STAT3-c Myc等6条途径参与大鼠部分肝切除后的肝脏再生调控。谱函数分析发现,GADD45α调控的生理活动的变化情况基本与大鼠肝再生进程相符。结论 GADD45α在大鼠肝再生中可能通过上述信号通路调控细胞增殖、细胞周期和细胞存活等生理活动,进而调节肝脏的再生。

GADD45β在肝癌中的异常表达

目的:探讨生长抑制DNA损伤诱导因子β(GADD45β)与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生、发展的关系.方法:应用寡核苷酸基因芯片、反转录PCR(RT-PCR)、免疫组织化学技术检测GADD45β在人正常肝组织、肝硬化组织和肝癌组织中的异常表达,分析GADD45β与临床病理学特征的关系及其异常表达的可能分子生物学机制.结果:正常肝组织、肝硬化组织和肝癌组织中GADD45β mRNA的阳性表达率分别为80%、60%和26%,肝癌组织与正常肝组织间有非常统计学差异(χ2=15.128,P<0.01);GADD45β蛋白的阳性表达率在正常肝组织、肝硬化组织和肝癌组织中分别为85%、70%和31%,有显著统计学差异(χ2=24.619,P<0.01).GADD45β在肝癌组织中的表达缺失与病理学分级显著相关(P<0.01).结论:GADD45β作为抑癌基因在肝癌的发生发展中起到相当重要的作用,且与肿瘤分化程度密切相关.

半滑舌鳎Gadd45g3基因的克隆与表达分析

生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45 （growth arrest and DNA damage inducible protein 45,Gadd45）基因在胚胎发育和性别决定中起重要作用.本研究通过RACE方法在半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）中克隆得到了1个Gadd45g同源基因,命名为Gadd45g3.该基因全长1 147 bp,编码155个氨基酸残基.氨基酸序列分析表明,半滑舌鳎Gadd45g3与其他鱼类Gadd45g-like的同源性为79％～88％,与硬骨鱼和高等脊椎动物的Gadd45g同源性为58％～67％.对多个物种的Gadd45g同源基因的CDS区进行Ka/Ks分析,发现Ka/Ks均小于0.3.FISH结果显示,半滑舌鳎Gadd45g3基因位于常染色体上.实时荧光定量PCR结果显示,Gadd45g3在雌雄成鱼的脑中都有很高的表达,说明其参与了神经发育;在成熟性腺中,Gadd45g3的表达具有精巢特异性,说明Gadd45g3是性别相关基因;而在不同发育时期的性腺中,Gadd45g3的表达量在孵化后20 d的雄性仔鱼中显著高于同龄雌鱼（P＜0.05）,但在孵化后95 d的雌雄仔鱼中均有高表达,说明在半滑舌鳎性别决定和性腺发育中起着重要作用.

辐射诱导Gadd45基因表达作为生物剂量计的实验室评估

为了考察电离辐照后人外周血中Gadd45基因表达的个体差异,评价Gadd45作为基因表达辐射生物剂量计的实用性,采集了27个健康人外周血进行60Co照射,提取白细胞mRNA,以β-actin作为内对照基因,建立了相对标准曲线法实时定量聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)方法,并以此方法探索辐照后Gadd45表达的剂量-效应关系。结果表明,0～2.5Gy剂量范围内,Gadd45的mRNA表达水平随照射剂量增加而上调,通过拟合建立了0～2.5Gy剂量范围内,Gadd45/β-actin相对表达量与照射剂量间的剂量-效应直线方程(y=0.216+0.258x,p<0.001,R2=0.650)。发现Gadd45 mRNA表达水平在个体间存在一定差异,应用该剂量-效应直线方程,可以对0～2.5Gy照射剂量范围内的血液照射剂量作相对估算。

GADD45β基因表达诱导对不同p53状态的肝癌细胞作用

目的:体外合成GADD45β基因全序列表达质粒后,研究GADD45β基因表达诱导对呈不同p53状态的肝癌细胞的作用及可能机制。方法:采用RT-PCR法获得GADD45β基因全序列,插入pDrive穿梭克隆载体和pIRES2-EGFP荧光表达载体后大量扩增获得DNA,结合p53全基因表达质粒pp53-EGFP转染HepG2、Hep3B细胞后,以[3H]胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法(3H-Tdr)和细胞克隆形成法分析DNA合成变化及细胞生长能力;以双抗体夹心ELISA法测定TGF-β1表达变化。结果:成功合成GADD45β基因全序列和表达质粒,通过流式细胞仪收集转染阳性的荧光表达细胞能显著提高转染效率;转染GADD45β后,具有野生型p53基因的HepG2细胞的细胞克隆形成能力和DNA合成能力明显受到抑制,细胞凋亡明显增加,TGF-β1的表达亦明显受抑。与之相反,缺失p53基因的Hep3B需要同时共转染p53基因后,方出现抑制效应。结论:GADD45β基因能够有效抑制肝癌细胞的生长,其功能需要完整p53基因的辅助和(或)调控。GADD45表达和(或)功能异常,导致p53介导的DNA损伤修复途径异常或阻断,是肝脏细胞恶性转化及形成肿瘤的可能机制。

眼镜蛇毒因子耗竭补体对大鼠Thy-1肾炎凋亡病变及其Gadd45α基因表达的影响

目的:研究眼镜蛇毒因子(CVF)耗竭体内补体对Thy-1肾炎大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)凋亡病变及其生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45α(Gadd45α)基因表达的影响。方法:利用抗胸腺细胞抗血清(ATS)复制大鼠Thy-1肾炎(Thy-1 N)模型。大鼠随机分为正常对照组、Thy-1 N组和CVF+Thy-1 N组。取各组大鼠血清检测补体CH50活性。另取各组大鼠肾皮质,行电镜和TUNEL染色检查判断其肾组织细胞凋亡的病理变化;用RT-PCR和real-time PCR检测大鼠肾组织凋亡相关基因,即Gadd45α mRNA丰度;用Western blotting检测Gadd45α蛋白表达水平。结果:CVF+Thy-1 N组补体CH50活性明显下降,与Thy-1 N组和正常对照组相比差异明显(P<0.01)。电镜和TUNEL染色观察到Thy-1 N组大鼠GMCs有凋亡病变,而CVF+Thy-1 N组凋亡病变则显著减轻。Thy-1 N组大鼠肾皮质Gadd45α mRNA 40min开始上调,3h达到峰值,而用CVF处理的Thy-1 N大鼠,Gadd45α mRNA丰度则明显低于Thy-1N组(P<0.01);Thy-1 N组Gadd45α蛋白水平3h时显著增多,而CVF+Thy-1 N Gadd45α蛋白水平明显低于Thy-1 N组(P<0.01)。结论:CVF耗竭补体可显著减轻大鼠Thy-1肾炎凋亡病变并抑制Gadd45α基因的表达。