用噬菌体展示筛选Gal-α-1,3-Gal的模拟肽

猪心移植是解决心脏移植供体少的有效方法 .由于猪心血管内皮细胞表面抗原半乳糖 α 1,3 半乳糖 (Gal α 1,3 Gal) ,能与人体内预存的天然抗体结合产生超急性排斥反应 (HAR) ,而无法应用于临床 .为了解决这一难题 ,应用噬菌体展示技术 ,筛选出一个能与抗B型血单克隆抗体 (mABanti B)特异性结合的阳性噬菌体克隆 ,应用酶联免疫吸附测定 (ELISA)和竞争性ELISA结果表明 ,所获得的阳性噬菌体克隆能特异性地与mABanti B结合 ,并且这种结合可被蜜二糖 (具有Gal α 1,6 Glc的结构 )所竞争抑制 .由此推测 ,筛选到的噬菌体阳性克隆很可能就结合在蜜二糖与mABanti B结合的位点 .同时 ,进行了阳性噬菌体克隆的抑制猪红细胞凝集活性试验 ,试验结果表明 ,此阳性克隆不仅可抑制Gal α 1,3 Gal与抗体的结合 ,也可抑制Gal α 1,3 Gal与西非单叶豆凝集素 (GS I B4)的结合 .此噬菌体阳性克隆测序后 ,得小肽序列为CCWLLRQPVRFVRSIRS .鉴于以上的结果 ,认为此小肽可以作为Gal α 1,3 Gal的模拟肽 。

中国版纳近交系小型猪心脏异种抗原表位α1,3-Gal的分布

目的 研究中国版纳小型猪心脏的异种抗原α1,3 Gal的分布和半定量分析 ,为小型猪心脏的转基因和异种移植提供资料。方法 通过亲和免疫组织化学法和图像分析对 10头版纳小型猪心脏进行α1,3 Gal的分布和半定量研究。结果 α1,3 Gal主要分布于细胞膜 ,细胞浆也有少量表达 ,胞核无表达。在小型猪心内膜、心肌间质、心外膜、神经束膜等处有α1,3 Gal分布 ,心肌细胞未发现α1,3 Gal分布。半定量分析发现α1,3 Gal表达量心房内膜最多 ,心肌间质最少。结论 异种抗原α1,3 Gal在心脏中的表达存在较大差异 。

猪α-1,3-半乳糖转移酶基因打靶载体的构建

目的:构建猪α-1,3-半乳糖转移酶(GGTA1)基因的正负筛选打靶载体。方法:以原代猪胚胎成纤维细胞基因组DNA为模板,采用长程PCR方法扩增出GGTA1基因的2条片段;以长约2kb包含部分第9外显子的片段为同源短臂,在XbaⅠ和ClaⅠ位点插入pLoxP质粒正筛选标记neo基因的3'端;以长约5.4kb包括部分第8外显子、全部第8内含子及部分第9外显子的片段为同源长臂,于NotⅠ位点插入该质粒中neo基因的5'端;2.7kb的负筛选标记tk基因位于载体中同源短臂的3'端外侧。结果与结论:酶切、PCR及测序结果表明,同源臂被正确连接至质粒pLoxP,成功构建了猪GGTA1基因正负筛选打靶载体pSL/GT。

人类天然抗α-Gal抗体抑制肽的筛选

人类天然抗体可以与猪细胞抗原表位Gal α1,3 Gal结合 ,触发超急性排斥反应 (HAR) ,HAR是猪器官移植至人体时的首要障碍 .阻断人的天然抗体 ,阻止其与猪细胞表面特异性抗原的结合 ,是防止超急性排斥的有效措施 .利用噬菌体展示技术 ,从XCX15随机肽库中筛选与西非单叶豆凝集素 (GS I B4)特异性结合的噬菌体展示肽 .得到一个小肽序列为SCTALSFPSFAFLARGT ,其与人血清中天然抗体的结合可以被蜜二糖(melibiose)竞争性地抑制 ,同时该小肽还能抑制人类天然抗体介导的猪红细胞的凝集反应 .因此 ,筛选到的小肽能作为人天然抗α

2种Gal抗原缺失小鼠的免疫学特性比较研究

目的:考察2种Gal抗原缺失小鼠对外来抗原刺激的免疫应答特性,分析其用于Gal抗原阳性材料免疫毒性评价的敏感性。方法:采用外来Gal抗原(兔血红细胞,RRBC)免疫刺激2种Gal抗原缺失小鼠(GGTA1单基因敲除,KO与GGTA1/iGb3S双基因敲除,DKO),比较分析经免疫刺激后2种小鼠的免疫应答特性和敏感性,包括:特异性抗-Gal抗体水平,与免疫排斥反应及炎症反应相关的细胞因子表达水平和脾脏淋巴细胞亚型分型比例。结果:GGTA1/iGb3S DKO小鼠经腹腔内RRBC免疫刺激2次后,血清抗-Gal IgG和抗-Gal IgM水平与未接受免疫刺激的小鼠相比,分别升高约41倍和184倍;同时,脾脏T细胞亚型标志物(CD3^+CD8^+)水平轻度增高。GGTA1 KO小鼠经RRBC免疫刺激2次后,血清抗-Gal IgG和抗-Gal IgM水平与未接受免疫刺激小鼠相比,分别升高约92倍和407倍;同时,脾脏B细胞亚型标志物(CD3^-CD19^+)水平轻度升高。然而,与GGTA1/iGb3S DKO小鼠相比,可能由于个体间差异较大,除了2次免疫后抗-Gal IgG在800倍稀释,抗-GalIgM在3 200倍稀释时略高之外,其他并不存在显著性差异。2种Gal抗原缺失小鼠在RRBC免疫刺激后的NK细胞亚型标志物水平及细胞因子(IFN-gama,IL-4与IL-12P70)表达水平未见明显变化。结论:2种Gal抗原缺失小鼠均对外来抗原刺激具有较强的敏感性,表现为特异性抗-Gal抗体的显著升高,然而,GGTA1/iGb3S DKO小鼠与GGTA1 KO小鼠相比,未表现出更高的敏感性。因此,作为异种免疫原的免疫学评价模型,GGTA1 KO小鼠和GGTA1/iGb3S DKO小鼠都是敏感的实验动物模型。本研究采用的RRBC预免疫方法既能够提升小鼠的抗-Gal抗体水平,又不引起显著的免疫毒性反应,为后期用于动物源性生物材料的免疫学评价实验动物模型的应用奠定了基础。