Ganciclovir(GCV)与表达胸苷激酶的单纯疱疹病毒载体合用可使荷脑瘤大鼠长期存活

用单纯疱疹病毒(HSV)的缺陷株作为载体，感染肿瘤细胞治疗脑瘤的研究已取得了不少进展。本文报道将HSV—tk基因转移联合抗瘤药物GCV可使荷脑瘤大鼠长期存活。9L神经纤维肉瘤细胞用HSV载体hrR3转染，hrR3缺乏RNA还原酶，只能在肿瘤细胞中复制而不能在神经细胞中复制存活．同时还携带病毒胸苷激酶(tk)基因，RH105无tk基因．

HSV-tk/GCV系统杀伤ACC-M细胞的机理研究

目的 为探索HSV-tk/GCV(单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因/羟甲基无环鸟苷)基因治疗系统杀伤人高转移性腺样囊性癌细胞ACC-M 的机理。方法 采用荧光染色荧光显微镜观察、细胞DNA 电泳、流式细胞仪检测等方法。结果 研究发现,荧光染色有明显的细胞凋亡小体和染色质边聚现象;在GCV浓度较大(400 μm ol/L)作用时间较长(4 天)时有较明显的DNA 梯状现象;而FCM 发现在400 μm ol/LGCV 作用下有极明显的亚G1 峰。结论 HSV-tk/GCV基因治疗系统杀伤ACC-M

大鼠肝癌细胞HSV-tk/GCV自杀基因系统的构建及其旁观者效应

目的:构建针对大鼠肝癌细胞的HSV-tk/GCV(以下简称tk/GCV系统)自杀基因治疗系统,建立比较tk/GCV系统作用效果及其旁观者效应大小的细胞模型和检测方法.方法:用包装细胞PT67/tk分泌的重组逆转录病毒的活性颗粒感染大鼠肝癌CBRH7919细胞,用G418筛选3wk获得高耐药性的重组子CBRH7919/tk,扩大培养.提取CBRH7919(tk-),CBRH7919/tk(tk+)细胞的DNA,把HSV-tk基因片段用Dig标记为探针后,与2种DNA及阳性对照DNA进行点杂交,以检测tk+细胞的DNA是否整合有HSV-tk基因.用0.1、1、10、50、100mg/L的GCV体外作用于tk-、tk+细胞,MTT检测存活率.用GCV体外分别作用于含不同比例tk+细胞的tk+、tk-混合细胞,MTT检测存活率,比较分析各组旁观者效应大小,确定后续实验的合适tk+比例.结果:用G418筛选3wk后获到高耐药性的CBRH7919/tk(tk+)重组细胞.HSV-tk基因片段用Dig标记为探针后进行点杂交,检测到tk+细胞DNA上已整合有HSV-tk基因,而tk-细胞DNA不含HSV-tk基因.GCV对tk+细胞生长抑制和细胞毒作用明显,而且有浓度、时间依赖性,而tk-细胞对GCV不敏感,说明HSV-tk基因已表达且表达产物具有生物学活性.GCV对含5%和10%tk+的混合细胞杀伤率分别为6.0%和25.2%,结果表明5-10%的tk+混合比例下自杀基因系统自身的旁观者效应较低,而且用MTT检测旁观者效应大小时灵敏度比较高,可作为后续研究中药活性成分对旁观者效应增效作用的tk+、tk-混合比例.结论:成功构建了针对大鼠肝癌的HSV1-tk/GCV自杀基因治疗系统,建立了体外快速筛选旁观者效应增效药物的稳定有效的细胞模型和检测方法.

EB病毒LMP1通过NF-kB介导的HSV-tk/GCV治疗EBV相关肿瘤的研究

目的:研究EB病毒潜伏膜蛋白1(EBV-LMP1)通过活化NF-kB反式激活HIV-LTR进而启动自杀基困HSV-tk在EBV相关肿瘤治疗中的作用,为进一步开展肿瘤治疗提供科学的实验依据。方法:以鼻咽癌细胞为实验模型,将HSV-tk基因置于HIV-LTR调控序列之下,构建LMP1调控且依赖于NF-kB的HSV-tk/GCV系统,采用同位素方法检测tk活性来研究LMP1通过NF-kB调控HSV-tk转录的靶向性和表达特征,MTT方法检测在GCV处理下肿瘤细胞的生长状况。结果:成功构建受LMP1调控且依赖于NF-kB的HSV-tk表达质粒,发现其在GCV处理下,表达LMP1的肿瘤细胞的生长有显著的抑制。结论;携带有LMP1-HSV-tk的细胞对GCV治疗高度敏感,显示这一肿瘤治疗系统在EBV相关肿瘤中具有一定的应用前景。

基于GCV准则的小波图像去噪方法研究

小波软阈值去噪的关键在于阈值的选择。常用的阈值计算方法主要针对噪声信号为不相关的情况,并需要对噪声方差进行估计。对于含有未知噪声的信号,提出一种GCV准则确定阈值的小波去噪方法,并证明该方法得到的阈值是一种渐近最优解。该方法与常用的基于固定阈值和SURE阈值的去噪法进行比较,结果表明,无论是肉眼观察还是利用均方差和信噪比进行客观评价,基于GCV准则的小波去噪方法可以在噪声未知的情况下,有效的去除信号噪声,并很好的保留信号的原始特征。

HSV-tk/GCV系统对ACC-M细胞作用的体外试验

目的：为研究ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ系统对涎腺腺样囊性癌细胞株（ＡＣＣ－Ｍ）细胞的体外杀伤作用。方法：采用ＭＴＴ法和细胞计数法对ＧＣＶ在不同剂量和不同作用时间时细胞的生存率进行研究。结果：ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ系统能有效地杀伤ＡＣＣ－Ｍ细胞，杀伤呈时间依赖性和剂量依赖性，这种作用有比较明显的旁杀伤效应，旁杀伤效应的强弱与细胞间的接触程度呈正比关系。结论：ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ系统能有效地杀伤ＡＣＣ细胞，可望用于ＡＣＣ的治疗。

TK/GCV系统对骨肉瘤MG-63细胞杀伤的体外实验研究

目的:探讨脂质体介导的TK/GCV系统对骨肉瘤MG-63细胞的杀伤作用以及所产生的旁观者效应。方法:脂质体介导TK基因体外转染骨肉瘤MG-63细胞,倒置荧光显微镜观察细胞转染是否成功,流式细胞仪检测转染细胞与未转染细胞的转染效率。将未转染的骨肉瘤MG-63细胞分为3组,实验1组用转染TK/GCV的细胞上清液与原培养液按1/10、1/7、1/5、1/2比例混和液培养;实验2组用0.22μm滤器过滤的转染后的细胞上清液与原培养液按1/10、1/7、1/5、1/2比例混和液培养;对照组用培养液培养,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法分别测定各组细胞的生长抑制率及骨肉瘤细胞对TK/GCV系统的敏感性。结果:经TK基因转染的MG-63细胞,倒置荧光显微镜下有大量绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪检测转染TK基因的细胞转染效率可达75.5%。6 d后MTT检测结果显示实验1组中各比例浓度的混合培养液对细胞的抑制率与对照组相比有统计学意义(P<0.05);实验2组中1/10、1/7比例浓度的混合培养液对细胞的抑制率与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。经TK基因转染的MG-63细胞随GCV浓度增加,细胞凋亡率增加。结论:脂质体介导的TK/GCV系统能够通过旁观者效应抑制骨肉瘤MG-63细胞的生长。

pLTKcSN/VPC及GCV系统的旁观者效应观察

目的：探讨单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因（ＴＫ）逆转录病毒载体生产细胞（ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ）和更昔洛韦（ＧＣＶ）系统杀伤恶性胶质瘤细胞过程中的旁观者效应。方法：采用大鼠胶质瘤细胞Ｃ６、人恶性胶质瘤Ｕ８７ＭＧ和它们的转染ＴＫ阳性细胞Ｃ６ＴＫ，Ｕ８７ＴＫ，将Ｃ６与Ｃ６ＴＫ，Ｕ８７ＭＧ和Ｕ８７ＴＫ按比例（ＴＫ阳性细胞占细胞总体的０％～１００％，１０％梯度）分别混合培养于９６孔板中，每种混合比例设６孔。培养２４ｈ后，６孔中３孔加入浓度为０．５μｇ／ｍｌＧＣＶ，另外３孔作为空白对照。继续培养７２ｈ，直接计数各孔活细胞数并以对照组计数结果为本底计算ＧＣＶ对各混合比例的抑制率。结果：当ＴＫ阳性细胞占１０％时，Ｃ６和Ｕ８７ＭＧ组的抑制率达到或超过３０％，当ＴＫ阳性细胞占总体的５０％以上时，ＧＣＶ对各混合比例的抑制率接近１００％。结论：ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ和ＧＣＶ系统杀伤恶性胶质瘤细胞过程中存在明显的旁观者效应。

细胞缝隙连接与HSV-TK/GCV系统旁观者效应的关系

在用单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)自杀基因系统治疗肿瘤的研究中,一个有趣和重要的现象就是旁观者效应(bystander effect,BE)。它在很大程度上提高了HSV-TK/GCV系统治疗肿瘤的疗效。但到目前为止,BE的确切机制尚未阐明。大量研究表明,靶细胞连接蛋白(connexin,Cx)的表达及其形成的细胞间缝隙连接(gapjunction,GJ)与这一现象关系密切。该文对GJ与HSV-TK/GCV系统BE的关系作一综述,并探讨了由HSV-TK/GCV系统生成可经GJ传递的"死亡信号"的性质。

HSV-tk/GCV自杀基因系统对喉癌细胞杀伤作用的体外研究

目的 研究逆转录病毒介导的HSV tk/GCV系统对人喉癌细胞的体外杀伤作用。方法 构建携带HSV tk基因的逆转录病毒载体 ,并以该重组逆转录病毒感染人喉癌细胞Hep 2。以G4 18筛选的抗性克隆 (命名为Hep 2 /tk) ,用MTT比色法观察GCV在体外对Hep 2 /tk细胞的杀伤作用。结果 Hep 2 /tk细胞与未转染tk基因的Hep 2 /0、Hep 2细胞相比较 ,三者的生长速度无明显差别。Hep 2 /tk细胞对GCV高度敏感 ,即低浓度GCV(0～ 1mg/L)处理Hep 2 /tk细胞 7d,可将其大部分细胞杀死 ,增加GCV的浓度 (>1mg/L)不能显著增强其对Hep 2 /tk细胞的杀伤作用。 结论 人喉癌细胞Hep 2对HSV tk/GCV系统高度敏感 。

重组IFN-α2a与HSV-tk/GCV系统协同作用增强对于卵巢癌细胞系SKOV3杀伤作用的体外研究

目的 :观察应用重组IFN α2a能否增强单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因 (HSV tk) /丙氧鸟苷 (GCV)系统对卵巢癌细胞系SKOV3的杀伤效应。方法 :利用逆转录病毒载体将潮霉素磷酸转移酶和HSV tk的融合基因 (hytk)导入SKOV3细胞 ,测定GCV对SKOV3/hytk细胞的杀伤作用和旁观者效应。观察IFN α2a与HSV tk/GCV协同作用对旁观者效应的影响 ,并且在联合应用GCV和IFN α2a后 ,进行细胞周期分析。结果 :GCV对SKOV3/hytk细胞有明显的杀伤作用 ,并且可以同时杀伤周围未转基因的细胞 ,联合应用IFN α2a与HSV tk/GCV可以明显增强旁观者效应 (P <0 .0 5 ) ,使处于S期的SKOV3/hytk细胞较对照组和使用单药组明显增多 (P <0 .0 1)。结论 :IFN α2a与HSV tk/GCV联合应用可以产生协同作用 ,增强HSV tk/GCV系统在体外对卵巢癌细胞系SKOV3的杀伤效应 。

乳腺癌特异性多肽介导的HSV-TK/GCV系统的构建及其靶向杀伤效应

目的:研究乳腺癌MDA-MB-231细胞特异性转导多肽PI介导的HSV-TK/GCV抗瘤系统对乳腺癌MDA-MB-231细胞的体外靶向杀伤作用。方法:以PCR从质粒pORF-HSV-TK中扩增目的基因PI-TK,克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建pET-28a(+)-PI-TK载体,转化宿主菌,经IPTG诱导表达PI-TK融合蛋白,利用His-Tag对其进行纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定PI-TK融合蛋白。将不同质量浓度的PI-TK融合蛋白与MDA-MB-231细胞共培养,联合更昔洛韦(ganci-clovier,GCV)作用后,倒置显微镜下观察细胞的形态变化,CCK-8法检测MDA-MB-231细胞的增殖。结果:成功构建了重组原核表达载体pET-28a(+)-PI-TK,获得纯化的PI-TK融合蛋白,SDS-PAGE及Western blotting鉴定PI-TK融合蛋白表达正确。单独PI-TK融合蛋白不影响MDA-MB-231细胞的形态和增殖,但PI-TK融合蛋白联合GCV能剂量依赖性靶向抑制MDA-MB-231细胞的增殖,200μg/ml PI-TK+10 mg/LGCV作用的抑制率达(68.9±7.57)%;PI-TK联合GCV抑制MDA-MB-231细胞的IC50值为152.64μg/ml。上述各作用对MDA-MB-435细胞均无影响(P<0.05)。结论:乳腺癌特异性转导多肽PI介导的HSV-TK/GCV抗瘤系统可靶向杀伤MDA-MB-231细胞。

HSV-TK/GCV系统对人肺癌细胞株的杀伤效应

目的 观察单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV -TK/GCV系统对人肺癌细胞H4 4 6的体外杀伤作用。方法 利用脂质体(lipofectin)将重组逆转录病毒载体pLXSN -TK导入包装细胞PA317,G4 18筛选至抗性克隆出现 ,收获病毒液。加入聚凝胺感染H4 4 6细胞 ,并筛选出含TK基因的H4 4 6细胞。观察GCV对H4 4 6和不同比例混合的H4 4 6、H4 4 6 /TK的杀伤作用及旁观者效应。结果 经电镜及PCR检测证实TK基因已导入PA317、H4 4 6细胞。H4 4 6 /TK细胞对GCV的敏感性明显高于H4 4 6细胞 ;随着TK+ 细胞比例的增加 ,存活率进一步减低 ,提示GCV不仅杀死TK+ 细胞 ,也杀死混合培养的未转导TK基因的H4 4 6细胞 ,表明HSV -TK基因转导的H4 4 6细胞具有明显的旁观者效应。结论 HSV -TK/GCV系统赋予人肺癌细胞对GCV的高敏感性及旁观者效应。

基于GCV准则与Otsu法的Canny算子研究

为了增强图像的可读性,解决因光照、噪声等因素造成的图像模糊、边缘不清等问题,在前人研究的基础上提出了对Canny算子的改进。用遗传算法对基于GCV准则的阈值函数自动寻优,在降低噪声的同时增强了图像的可读性;用评价函数对Otsu法自适应设定高低阈值,无需考虑阈值比例,减少了伪边缘现象。不同图像的边缘提取实验和数据分析表明,该方法在检测精度、抗噪能力和运算效率等方面都得到明显提高。对于存在的不足提出了进一步研究方向。

Psi2STK/GCV与鼠C6神经胶质瘤细胞的相互作用

目的 :研究利用基因工程包装细胞进行基因转导与药物相结合来治疗脑胶质瘤的可行性。方法 :利用基因转导技术及分子生物学方法构建了逆转录病毒载体 STK及基因工程包装细胞psi2 STK,并利用 psi2 STK细胞和丙氧鸟苷 ( GCV)结合对胶质瘤细胞进行了离体的基因治疗研究。结果 :实验组 C6Bp BAG+ psi2 STK由于有 psi2 STK细胞的存在 ,对 GCV的敏感性比对照组C6Bp BAG+ psi2 STK明显增强。结论 :通过体外实验证实了逆转录病毒转导 HSV- TK基因 ,在培养 C6胶质瘤细胞中 ,提高了其对

HSV_1-TK/GCV系统对人肺腺癌细胞A549生物学特性的影响

目的 观察转TK基因肺癌细胞对丙氧鸟苷 (GCV)的敏感性及TK GCV系统杀灭肿瘤细胞机制。方法 观察转TK基因、转空载体A5 49细胞 (下分别简称A5 49 TK、A5 49 pLXSN)和A5 49细胞形态学改变、生长增殖特性。GCV对 3种细胞生长抑制 (MTT法 )。电镜、流式细胞仪观察A5 49 TK、A5 49细胞经 5 0μmol LGCV作用 3d后细胞凋亡。 结果 转基因细胞变为不规则 ,呈多角型 ,透亮度下降 ,体外增殖能力下降 ,A5 49 TK ,A5 49 pLXSN ,A5 493种细胞倍增时间分别为 42 .3 5、41.75、3 6.18h。依据IC5 0 ,A5 49 TK细胞对GCV敏感性比A5 49细胞提高 46倍 ,电镜发现A5 49 TK细胞有凋亡小体 ,核呈半月征等 ,流式细胞仪发现A5 49 TK、A5 49细胞亚G0 G1 期分别为 ( 12 .2 1± 1.76) %、( 1.3 2± 0 .47) % ,两者比较P <0 .0 1。结论 A5 49 TK细胞获得了对GCV敏感性 ,TK GCV杀灭肿瘤细胞与诱导凋亡有关。

HSV-TK/GCV自杀基因系统对人胰腺癌细胞的作用

目的 运用自杀基因系统HSV TK/GCV治疗人胰腺癌细胞SW1990的实验研究 ,并证实旁观者效应。方法 通过脂质体介导的基因转移方法将含有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (her pessimplexvirusthymidinekinasegene ,HSV TK)的复制缺陷型逆转录病毒载体GINaTK导入包装细胞PA317,然后利用细胞产生的假病毒颗粒感染人胰腺癌细胞系SW 1990细胞。在SW 1990 /TK细胞培养物中加入抗病毒前药GCV ,观察GCV对该细胞的杀伤作用及旁观者效应。结果 实验表明GCV对SW1990 /TK有显著的抑制及杀灭作用 ,同时表现出强烈的旁观者效应。结论 HSV TK/GCV自杀基因系统对胰腺癌细胞有生长抑制及杀伤作用 。

基于GCV理论的小波自适应多阈值图像去噪方法

小波图像去噪是小波应用较成功的一个领域,而其中最重要的一个环节就是最优阈值的确定问题。提出了一种基于小波变换的多阈值图像去噪的改进方法。这种方法是在各分解尺度上的各子带选择不同的最佳阈值,而最佳阈值的选取是基于GCV理论。利用此理论不仅能获得最小均方意义上的渐进最优解,而且不需要知道噪声的先验知识。通过实验证明,这种方法不仅能获得很好的去噪效果,而且由于不需要对噪声进行估计从而减小了计算量。

应用RV-HSV-TK基因转染胰腺癌细胞及转染阳性的细胞对GCV敏感性研究

由缺陷型逆转录病毒介导的TK基因系统（RV－HSV－TK）是众多肿瘤生物治疗方法中一个技术较为成熟的方案，本实验采用该系统在体外成功地转染了人胰腺癌细胞株SW1990并能够稳定传代培养，转染了TK基因的SW1990细胞（SW±K），其生长曲线与未转染的SW1990细胞无差异。10－4～102μg／ml的GCV对SWtk有明显的毒性作用（IC50＝2．5μg／ml），杀伤效应与时间成正比，作用48小时以后开始出现毒性作用。将SW1990细胞与包装细胞共孵育48小时以上，再加入10μg／ml的GCV作用120小时，约有50％的SW1990细胞被杀死。结果表明：采用RV－HSV－TK系统转染胰腺癌细胞，有较高的转染效率，转染了TK基因的胰腺癌细胞对GCV敏感。