橡胶灵芝菌(Ganoderma pseudoferreum)DNA条形码检测筛选（英文）

选用10对DNA条形码标准序列ITS、COI、nrDNA-LSU、nrDNA-SSU和trnL DNA对海南和云南红根病区分离的21个橡胶灵芝菌进行检测。除COI和trnLDNA外,其他8对引物均扩增得到PCR产物,产物大小范围为268～1355bp,种内相似度为98.05%～99.54%。分别将扩增得到的序列与GenBank公布上的Ganoderma属和常见真菌属序列,共77个ITS、74个nrDNA-LSU和74个nrDNA-SSU序列进行系统进化树构建与分析。结果表明:nrDNA-LSU序列和nrDNA-SSU序列种间差异较小,不能准确区分Ganoderma属及其他属;5对ITS序列均能区分Ganoderma属,但仅ITS1/ITS4序列能将Ganoderma属下16个种归入不同分支。ITS1/ITS4序列表现出适宜的种内与种间差异,适宜作为G. pseudoferreum的DNA条形码。

橡胶灵芝菌内参基因筛选与分析

【目的】分析评价不同胁迫处理的橡胶灵芝菌候选内参基因的稳定性,为探索橡胶灵芝菌基因的功能及其侵染橡胶树的分子机制等提供参考。【方法】以5个非生物因子(温度、盐、氧化、pH、干旱)和1个生物因子(生防细菌)胁迫下的橡胶灵芝菌作为材料,提取RNA并反转录为cDNA,采用实时荧光定量PCR技术,扩增6个候选内参基因(UBC、ACT、RPL6、β-TUB、APT、28s),利用分析软件geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder根据基因表达的稳定性对基因进行排序,选择最适合不同胁迫的内参基因组合。【结果】所有样品RNA均为清晰的两条带,且6个候选内参基因的熔解曲线为明显单一峰。结合geNorm、NormFinder、Bestkeeper和RefFinder对其进行表达稳定性分析发现,温度胁迫下基因表达稳定性为UBC>ACT>RPL6>β-TUB>28s>APT,盐胁迫下基因表达稳定性为ACT>RPL6>UBC>APT>β-TUB>28s;氧化胁迫下基因表达稳定性为UBC>ACT>28s>APT>β-TUB>RPL6;pH胁迫下基因表达稳定性为RPL6>UBC>APT>ACT>β-TUB>28s,干旱胁迫下基因表达稳定性为ACT>UBC>β-TUB>RPL6>APT>28s,生物胁迫下基因表达稳定性为UBC>ACT>RPL6>28s>APT>β-TUB。【结论】结合所有候选基因稳定性和胁迫条件,推荐基因ACT和UBC作为在干旱、氧化、温度和生物胁迫下的内参基因,基因ACT和RPL6为盐胁迫下的内参基因,UBC和RPL6为pH胁迫下的内参基因。本研究结果为不同胁迫下橡胶灵芝菌相关基因的表达研究提供了合适的内参基因。

橡胶树红根病病原菌木聚糖酶编码基因GpTR1774的克隆与表达分析

细胞壁降解酶是诸多病原真菌的重要致病因子,其中木聚糖酶作为最重要的半纤维素酶,在丝状真菌降解细胞壁侵染寄主的过程中占有重要作用。本研究以橡胶树红根病病原菌HD3为材料,采用RT-PCR克隆木聚糖酶编码基因GpTR1774的基因序列,对其进行生物信息学分析;用HD3侵染橡胶树热研73397组培苗根部,电镜观测病原菌对根部细胞的侵染和破坏过程,并利用qRT-PCR方法测定不同侵染时间GpTR1774基因的表达量。结果表明:GpTR1774基因cDNA全长为780bp,编码259个氨基酸,其中含量最丰富的氨基酸为丙氨酸(Ala),占15.1%;预测蛋白分子量为28.12 kDa,脂肪系数为81.93,等电点为9.07,属亲水性蛋白,共有15个磷酸化位点,无信号和肽跨膜域,定位于细胞溶质;α-螺旋和无规则卷曲是GpTR1774蛋白二级结构的主要元件,分别占氨基酸序列的38.10%和41.31%。系统进化树分析显示,GpTR1774基因与狭长孢灵芝木聚糖酶基因相似度最高,达87.5%。qRT-PCR显示,木聚糖酶GpTR1774基因表达量整体趋势为先上升后下降,侵染3 d和4 d表达量极显著上升,4 d达到最高水平,约为侵染初始的16倍。本研究结果初步表明,木聚糖酶编码基因GpTR1774很可能参与橡胶树红根病病原菌的致病过程,为橡胶树红根病的致病机理解析和绿色防控提供参考。

枯草芽孢杆菌Czk1挥发物混合活性组分对橡胶灵芝菌的抑菌机理

红根病是我国分布广、发病率高、危害较为严重的橡胶树根部病害。为明确枯草芽孢杆菌Czk1菌株产生的挥发性物质对橡胶红根病原菌橡胶灵芝菌(Ganoderma pseudoferreum)的抑菌作用,以挥发性物质的主要成分苯甲醛、3,5-二甲氧基苯乙酮、2,6-二叔丁基对甲酚为研究对象,分析其对橡胶灵芝菌的糖、蛋白、DNA、关键代谢酶活性、细胞内容物泄露情况的影响。结果表明,经挥发物混合活性组分处理后,橡胶灵芝菌糖类含量显著降低;高浓度的枯草芽孢杆菌Czk1菌株挥发物混合活性组分影响其蛋白质的合成;DNA分子量变化不明显,未破坏橡胶灵芝菌DNA的一级结构。关键代谢酶活性(苹果酸脱氢酶、几丁质酶)降低,细胞内溶物泄漏情况明显。挥发物混合活性组分可能是通过破坏橡胶灵芝菌的细胞膜结构,扰乱物质代谢活动,从而达到抑菌作用。

Bacillus subtilis Czk1挥发性化合物对橡胶树红根病菌的抑制作用

由橡胶灵芝菌(Ganoderma pseudoferreum)引起的红根病是橡胶树生产上毁灭性病害之一。为明确枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Czk1产生的挥发性物质对橡胶灵芝菌的抑制作用,以橡胶灵芝菌为靶标菌,通过平板对峙法检测Czk1所产12种挥发性化合物纯品的抑菌活性;采用生长速率法对挥发性活性组分进行毒力测定;检测挥发性混合组分对橡胶灵芝菌细胞的形态及细胞膜通透性的影响。结果表明,12种挥发性化合物纯品对橡胶灵芝菌均具有不同程度的抑菌活性,其抑菌率在15.20%~100%之间,其中,苯甲醛对橡胶灵芝菌抑菌活性最强,抑菌率达到100%。9种化合物纯品对病菌的毒力测定中,苯甲醛、3,5-二甲氧基苯乙酮、2,6-二叔丁基对甲酚EC50分别为20.30、30.62、40.96μg·mL^-1。该三种混合组分浓度为25μg·mL^-1,其对橡胶灵芝菌的抑制率为67.00%。经三种混合活性组分处理后的病菌菌丝缠绕成一团,细胞壁变薄,部分膜结构不完整。混合活性组分影响病菌细胞通透性。Czk1产生的挥发性物质具良好的抑菌活性是由这些挥发性物质协同作用的结果,这些挥发性物质应用前景巨大,可作为化学农药替代品防治橡胶树红根病。

不同地区橡胶树红根病菌的生物学特性及室内毒力测定

橡胶树红根病是我国分布最广、危害最重的橡胶树根部病害。为明确我国海南和云南地区橡胶红根病菌的生物学特性及对杀菌剂的敏感性,采用十字交叉法研究了不同培养条件对病菌菌丝生长的影响,并测定了10种不同杀菌剂对病菌的抑制作用。结果表明,病原菌在玉米+橡胶根的培养基上生长最快,对温度、pH等适应范围广,温度在13～31℃,pH在3～10均能生长,最适生长温度为28℃,多数菌株最佳pH为7～9,且能利用多种碳氮源;不同的碳源中,果糖、半乳糖、麦芽糖、葡萄糖和甘露糖较适合该菌的生长;在供试氮源中,菌丝在酪氨酸、牛肉浸膏的基础培养基上生长最快,在色氨酸和尿素的基础培养基上生长最慢;光照对病菌有抑制作用,黑暗有利于菌丝生长;菌丝的致死温度为47℃,10 min。不同地区的病原菌株间药剂敏感性存在一定差异,戊唑醇抑菌效果最好,其EC_(50)为0.0312μg/mL,其次为嘧菌酯、十三吗啉、咪鲜胺和腈菌唑,EC_(50)分别为0.5581、0.6759、1.3763和1.5603μg/mL。

巴西橡胶树红根病菌DNA提取有效方法比较

旨在筛选适用于橡胶树红根病菌DNA提取的有效方法并评价其效果。利用CTAB改良法、氯化苄改良法、SDS改良法等3种方法提取橡胶树红根病菌菌丝体DNA,并通过紫外吸收光谱和琼脂糖凝胶电泳对DNA样品进行检测,比较提取DNA的产量、质量;再选用提取效果最好的方法提取5个时间段(4、6、8、10、12天)的菌丝DNA并进行ITS-PCR检测。CTAB改良法提取的样品DNA纯度最好,产率最高,OD260/OD280为1.82～1.84,浓度可达280μg/mL;培养4～6天的菌丝提取的DNA质量最高,适合PCR检测需要。CTAB改良法是一种适用于橡胶树红根病菌DNA提取的理想方法。

橡胶树红根病菌Fip-gpo基因的克隆及启动子分析

为预测橡胶树红根病菌(Ganoderma pseudoferreum)真菌免疫调节蛋白基因的序列特点和表达模式,采用同源克隆获得Fipgpo的c DNA和DNA的全长序列。结果表明:该基因编码区全长934 bp,编码111个氨基酸残基,分子量为12.54 k D,等电点4.66,有4个ATM磷酸化位点,与赤灵芝(G.lucidum)的Fip序列相似性为91%;其启动子区域含有59 bp的内含子,除了含有TATA-box、CAAT-box基本元件外,还含有参与光应答/调控元件、赤霉素响应元件、茉莉酸甲酯应答元件、厌氧诱导作用元件、调控在胚乳中特异表达的顺式作用元件、分生组织特异激活顺式元件及生长素反应元件。推测Fip-gpo基因的表达受激素、非生物诱导、光照等的调控。

八种杀菌剂对橡胶树红根病菌的毒力测定

采用生长速率法,在室内测定8种杀菌剂对橡胶树红根病病原菌Ganoderma pseudoferreum(Wakef.)Over.etsteinm GP-010菌株的毒力。结果表明:参试药剂对橡胶树红根病病原菌均具有较高的敏感性,其中12.5%己唑醇WP对橡胶红根病菌生长的抑制作用最强,其EC50值为0.04 mg/L;25%戊菌唑WP、25%丙环唑EC的抑制作用相对较强,其EC50值分别为0.29和0.32 mg/L,其余依次为75%十三吗啉EC、20%三唑酮EC、12.5%烯唑醇WP、25%咪鲜胺EC及25%腈菌唑EC,EC50值分别为0.46、1.38、1.46、2.39和2.94 mg/L。

橡胶树红根病菌具有差异化的营养需求

将分离自云南、海南两地的9株橡胶树红根病菌,分别在面粉培养基,MS培养基及二者各一半混合而成的培养基(1/2 MS)上培养,结果发现,其中7个菌株在1/2 MS上生长最佳,2个菌株在面粉培养基上生长最佳。同时,5个菌株在MS培养基上生长最慢,3个菌株在面粉培养基上生长最慢,一个菌株在1/2 MS培养基上生长较慢,这说明橡胶树红根病菌具有差异化的营养需求,而1/2 MS可以作为最有利于红根病菌生长的培养基。另外,病原菌在3种培养基上具有不同的形态特征,而且在1/2 MS培养基上最早出现黄化色变。

丙环唑防治橡胶树红根病田间试验

以海南橡胶树发生较严重的红根病为防治对象,采取田间大田试验的方法,用w=25%的丙环唑乳油和w=25%的丙环唑水乳剂进行防治,研究丙环唑对橡胶树红根病的防治效果和明确哪种剂型对橡胶红根病的防治更有效。结果表明,经DMRT法进行显著性测定,说明参试剂型对橡胶红根病的防治均有一定的防治效果。其中,w=25%的丙环唑乳油200倍液和400倍液对橡胶树红根病的防治效果最明显,其在第2次施药后,用w=25%的丙环唑乳油200倍液处理的病株率为15.00%,防治效果为78.57%,w=25%的丙环唑乳油400倍液病株率为15.83%,防治效果为77.83%,而w=25%的丙环唑水乳剂200倍液病株率为24.17%,防治效果为65.47%。从上述结果看,w=25%的丙环唑乳油和w=25%的丙环唑水乳剂对已感染红根病的橡胶树具有很好的防治效果,且在本试验使用浓度范围内对橡胶树安全。经示范后可在生产上推广应用,宜于发病初期,使用浓度为200～400倍液。

巴西橡胶树红根病病菌液体培养条件优化研究

通过设置不同碳源、氮源、温度、菌龄等对巴西橡胶树红根病病菌[Ganoderma pseudoferreum(Wakef)Over.et Steinm]进行液体培养试验。结果表明:适合橡胶树红根病病菌菌丝生长的液体培养基配方为:蔗糖1%,葡萄糖2%,D-果糖2%,玉米粉0.5%,酵母粉0.5%,黄豆粉0.8%,蛋白胨1%,KH2PO40.1%,Mg SO40.1%,VB1 0.02%;最适培养温度是29℃,液体菌种菌龄为120 h,培养周期为240 h。

75%十三吗啉乳油防治橡胶红根病田间药效试验

应用75%十三吗啉乳油防治橡胶红根病的田间药效试验结果表明:应用75%十三吗啉乳油50、100和150倍液,第2次药后30 d,防治效果分别为80.73%、76.33%和67.61%;第3次药后30 d,防效分别提高到83.82%、78.93%和71.91%,可见,75%十三吗啉乳油对已发红根病的橡胶树具有很好的防治效果,既起保护作用,也有治疗效果。

橡胶树红根病菌GPFTR1基因的克隆、亚细胞定位与表达分析

高亲和性铁通透酶FTR1是参与铁元素由胞外转移到胞内过程的重要铁转运蛋白。为了解橡胶树红根病菌(Ganoderma pseudoferreum (Wakef.) V. Over. et Steinm)的高亲和性铁通透酶编码基因GPFTR1,通过同源克隆技术,从橡胶树红根病菌中克隆得到GPFTR1的基因序列,并对其编码的氨基酸序列进行蛋白理化性质分析、保守结构域及跨膜区分析和系统进化树分析,并构建植物表达载体pBIN-GPFTR1-GFP进行该蛋白的亚细胞定位分析。利用生长速率法测定己唑醇和青蒿琥酯对橡胶树红根病菌的抑制率,并在EC50条件下进行橡胶树红根病菌的GPFTR1基因表达分析。结果表明,该基因编码区全长1 191 bp,编码396个氨基酸,推测其分子量为43.23 kD,等电点为6.92,为疏水性蛋白,具有保守基团REXLE和7个跨膜结构域;系统进化树分析显示GPFTR1与紫芝(Ganoderma sinense J. D. Zhao, L. W. Hsu&X. Q. Zhang)同类基因(登录号PIL27756.1)的亲缘关系最近,氨基酸同源性为89%;亚细胞定位结果显示GPFTR1蛋白定位在细胞膜上;生长速率法测定己唑醇和青蒿琥酯EC50分别为0.192 mg/L、26.288 mg/L;实时荧光定量PCR技术检测到GPFTR1蛋白编码基因分别在红根病菌受己唑醇和青蒿琥酯胁迫处理6 h和4 h表达量最高。为进一步研究橡胶树红根病菌GPFTR1基因功能提供了理论参考,对橡胶树红根病的防治具有重要意义。