重组牛乳源金黄色葡萄球菌GapC蛋白优势B细胞抗原表位的预测和筛选

旨在表达牛乳源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)GapC蛋白并对其B细胞抗原表位进行预测与鉴定,本研究利用实验室分离鉴定的S.aureus分离株15119扩增GapC基因并构建重组表达质粒pET-28a-GapC,诱导纯化得到分子量为44 kD重组蛋白GapC,以此免疫新西兰大白兔,获得特异多克隆抗体。利用生物信息学方法,对GapC蛋白的二级及三级结构进行分析,预测其B细胞抗原表位,并利用特异性抗体对筛选的表位进行鉴定。结果表明,GapC蛋白具有良好的免疫原性,筛选出7个线性B细胞抗原表位,利用兔抗重组GapC蛋白多克隆抗体鉴定得到了PL 5(^(221)IPEIDGKLDGGAQRVP^(236))多肽和PL 7(^(264)KNASNESFGYTEDEIVSSDVVGM^(286))2个优势B细胞表位。本研究成功制备了GapC蛋白,预测并鉴定了2个优势抗原表位,为其嵌合表位疫苗的开发提供了技术支持。

金黄色葡萄球菌重组GapC蛋白的GAPDH活性及免疫原性分析

为研究金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)表面GapC蛋白的GAPDH活性、免疫原性及免疫保护作用,应用PCR方法扩增出S.aureus的gapC基因,插入到pQE-30载体相应位点,构建重组质粒pQE/gapC。将其导入宿主菌E.coliM15(pREP4)后,IPTG诱导表达。重组蛋白纯化后进行GAPDH活性检测,并与灭活全菌体分别免疫健康家兔。然后,应用ELISA方法检测血清中IgG抗体水平及IFN-γ、IL-4细胞因子浓度,并用1.0×108CFU/mLS.aureus菌株Wood46对免疫家兔攻毒。SDS-PAGE结果显示,GapC蛋白在E.coliM15(pREP4)中获得表达;经GAPDH活性检测及WesternBlot检测,重组蛋白具有较高的GAPDH活性和抗原特异性;经ELISA检测,GapC蛋白及全菌体组兔血清中IgG抗体水平迅速升高,并在加强免疫后第28天达到最高(1:64000),加强免疫后第14d,血清中细胞因子IFN-γ和IL-4浓度与对照组相比,显著升高(P<0.05),而全菌体免疫组升高不明显(P>0.05);攻毒结果为蛋白免疫组家兔获得一定的免疫保护(4/5)。以上结果表明,表达的重组GapC蛋白具有GAPDH活性、较好的免疫原性及免疫保护力,可作为深入研究S.aureus基因工程疫苗的良好靶向。

金黄色葡萄球菌GapC蛋白与鼠伤寒沙门氏菌Flic融合蛋白的构建与免疫原性研究

目的探讨金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)GapC蛋白与鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,S.typhimurium)鞭毛蛋白融合蛋白的免疫保护作用。方法将纯化的Flic-GapC融合蛋白背部皮下接种免疫小白鼠,间隔3周免疫两次。应用间接ELISA方法测定小鼠血清中IgG抗体滴度;在二次免疫后2周,分离小鼠脾脏淋巴细胞,进行淋巴细胞增殖实验,利用Elispot方法检测IFN-γ和IL-4特异性分泌细胞;在二免后3周,用S.aureus Wood46株对免疫小鼠进行腹腔注射攻毒,观察1周并记录小鼠死亡数目。结果融合蛋白能够诱导小鼠产生特异性的免疫应答,二免后14d血清中IgG抗体滴度达到最高(1∶64 000),淋巴细胞刺激指数、分泌IFN-γ和IL-4的细胞数与对照组相比升高(P<0.05),对S.aureus的保护率达到70%。结论 Flic-GapC融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护作用,可作为S.aureus的疫苗靶向进行深入研究。

奶牛乳房炎性乳房链球菌GapC重组蛋白的免疫保护性研究

为研究奶牛乳房炎性乳房链球菌GapC蛋白的免疫保护性,本研究采用纯化后的GapC重组蛋白与免疫佐剂乳化后制备疫苗,免疫家兔后采用间接ELISA法检测抗体效价,并以小鼠为实验动物进行攻毒试验。结果显示,抗体效价高达1∶128 000,GapC蛋白免疫组对乳房链球菌的保护率较高,达70%,而全菌体免疫组的保护率仅为30%,表明GapC蛋白具有很高的免疫原性,为奶牛乳房炎的预防控制和进一步研究有效疫苗提供实验依据。

金黄色葡萄球菌GapC基因的克隆和表达

为研究金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)GapC蛋白,应用PCR方法扩增出S.aureus菌株BMSA/855/23-1的gapC基因,随后将其克隆到pMD18-T载体上。重组克隆pMD-T/gapC经测序后,与GenBank上已发表的序列进行对比分析。然后,将gapC基因插入到pQE-30质粒,构建重组质粒pQE30/gapC。重组质粒转化大肠杆菌E.coli M15(pREP4),IPTG诱导后,SDS-PAGE鉴定GapC融合蛋白的表达。结果表明成功扩增并克隆了S.aureus gapC,该菌株的gapC基因与GenBank上S.aureus BM10株的核苷酸序列一致性为99.3%,推导氨基酸序列一致性为99.4%。SDS-PAGE结果表明,GapC蛋白在E.coli M15(pREP4)中获得表达。

奶牛乳房炎链球菌GapC蛋白的生物信息学分析与重组表位疫苗设计

为设计奶牛乳房炎链球菌GapC蛋白的多表位串联疫苗,进一步提高GapC蛋白的免疫效果,采用DNAMAN、MEGA软件分析GapC的同源性与系统发生,结果显示,不同种类链球菌亲缘关系均较近,尤其是与奶牛乳房炎有关的链球菌亲缘关系更近。利用在线软件预测GapC为亲水性蛋白,存在多个酶切位点;采用Signal P 4.1与TMHMM Server v.2.0软件预测GapC无信号肽和跨膜结构,定位于细胞表面;SOPMA服务器预测GapC二级结构中含无规则卷曲30.36%,α-螺旋33.93%,β-转角12.50%,β-片层23.21%。采用Swiss-Model预测的GapC三级结构与二级结构相符。利用ABCpred和Bepi Pred方案,预测GapC存在5个B细胞表位。运用神经网络与量化矩阵法预测GapC具有1个CTL表位。使用MHC-Ⅱ类分子结合肽在线程序预测显示GapC具有1个Th表位。采用DNASTAR Protean软件重组GapC抗原表位,设计获得抗原性较好的GapC重组表位多肽。

链球菌GapC蛋白的表达及其多克隆抗血清的制备

本研究对乳房链球菌GapC蛋白基因进行了克隆、重组表达、蛋白纯化和免疫原性试验。应用PCR技术直接从临床分离的乳房链球菌菌株基因组中扩增出GapC蛋白基因,并将其克隆至pET28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)中表达。经DNA序列测定分析,扩增出的基因与GenBank发表的乳房链球菌GapC基因序列AF421900的同源性为99.8%,氨基酸同源性为100%;与GenBank发表的无乳链球菌GapC基因序列AF421899的同源性为91.4%;与停乳链球菌GapC基因序列AF375662的同源性为88.9%。表达的融合蛋白通过MagneHisTM蛋白纯化试剂盒纯化,纯化蛋白免疫小鼠3次,制备GapC抗血清。本研究表达和纯化了乳房链球菌GapC蛋白,并制备出鼠抗血清,为下一步开展GapC重组蛋白的应用研究莫定了基础。

无乳链球菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶C的B细胞抗原表位预测与鉴定

旨在表达牛源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)甘油醛-3-磷酸脱氢酶C (GapC)蛋白并对其免疫效果进行评估,预测并鉴定其优势B细胞抗原表位。本研究对无乳链球菌X16087株的GapC基因扩增,构建重组质粒pET-28a-WR-X16087,经诱导表达后纯化GapC蛋白,免疫小鼠并分析免疫效果。对GapC蛋白进行生物信息学分析,预测并鉴定其B细胞表位。结果表明,重组质粒经诱导表达纯化后,获得大小为44 kDa的目的蛋白,免疫小鼠后抗体效价可达1∶218 700,抗体亚型以IgG1和IgG2b为主;小鼠免疫后保护率可达100%;GapC免疫后可显著减少攻击后小鼠肝、脾、肺、肾中的菌体载量;GapC蛋白可减少细菌入侵对小鼠造成病理损伤。预测并筛选了GapC的B细胞表位,确定了3个具有良好抗原性的B细胞线性表位,分别为:~(46)KYDTTQGRFDGTVEVKDG~(63)、~(121)TAPGGNDV~(128)、~(186)MVLDGPHRGGDLRRAR~(201)。鉴定表明,3个B细胞表位有成为牛源无乳链球菌预防性表位疫苗的潜力。

停乳链球菌GapC的免疫特性分析及B细胞抗原表位的筛选与鉴定

旨在表达牛乳源停乳链球菌3-磷酸甘油醛脱氢酶(GapC),预测并鉴定其B细胞抗原表位。本研究采用PCR扩增停乳链球菌GapC基因,构建重组质粒p ET-28a-TR-X16087-2。经IPTG诱导表达后纯化GapC蛋白,并以纯化的GapC蛋白免疫小鼠,采用ELISA方法检测Ig G抗体效价及抗体分型,分析对小鼠的免疫保护效力。结果显示,成功表达了大小为44 ku的GapC蛋白,对小鼠的免疫保护率为76%。预测并筛选出3个B细胞抗原表位,鉴定了1个优势抗原表位BP3:^(196)PHRGGDLRRARAGAAN^(206)。上述结果表明,本研究成功表达了停乳链球菌GapC蛋白,对其免疫效果进行了评估,预测与鉴定了其B细胞表位,为GapC蛋白功能和表位疫苗的研究奠定了基础。

金黄色葡萄球菌GapC蛋白与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的融合表达及其活性

目的在大肠埃希菌中融合表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus.aureus,S.aureus)GapC蛋白与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白,并检测其甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)活性。方法采用PCR技术分别扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白flic基因和S.Aureus GapC基因,通过overlap PCR将这两段基因拼接并克隆至载体pQE30a,构建重组表达质粒pQE30-flic-GapC,将重组表达质粒转化E.coli XL-blue,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱亲和层析试剂盒纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot分析,并检测其GAPDH活性。结果重组表达质粒pQE30-flic-GapC经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达产物相对分子质量约95 000,最佳诱导表达时间为5 h,主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的31.4%;纯化产物可与小鼠抗S.aureus全菌体多抗血清和抗鼠伤寒沙门菌全菌体多抗血清发生特异性反应,GAPDH活性为(0.337±0.019)。结论成功表达并纯化了具有较高生物学活性的flic-GapC融合蛋白,为S.aureus亚单位疫苗的研究奠定了基础。