Gardiquimod增强人γδT细胞杀伤肿瘤细胞的研究

目的研究Toll样受体7激动剂（Gardiquimod）对人γδT细胞杀伤肿瘤作用的影响。方法以异戊烯焦磷酸法扩增人外周血γδT细胞。用不同浓度的Gardiquimod处理γδT细胞和肺癌细胞A549,MTT法检测细胞增殖情况。LDH法检测Gardiquimod处理后γδT细胞对A549的杀伤活性;流式细胞术检测处理前后γδT细胞上CD107a、穿孔素和颗粒酶的表达情况。结果 Gardiquimod在5.0~0.31μg/ml浓度可明显促进γδT细胞增殖,同时抑制A549增殖。Gardiquimod处理γδT细胞后,杀伤A549能力明显增强,且CD107a、颗粒酶及穿孔素的表达显著升高,与对照组相比,有统计学差异（P〈0.05）。结论 Gardiquimod通过增高γδT细胞上的CD107a、颗粒酶及穿孔素的表达来增强其杀伤肿瘤作用。

TLR7激动剂Gardiquimod上调BxPC-3细胞中IL-15 mRNA表达

目的研究TLR7在胰腺癌Bx PC-3细胞中表达,并探讨TLR7激动剂激活TLR7后细胞因子白介素15(IL-15)的表达。方法通过Western blot和Real-time PCR分析TLR7在细胞内的表达水平;Bx PC-3细胞经过不同时间点Gardiquimod(3μg/ml)的处理后,Real-time PCR分析TLR7激活后IL-15 mRNA水平表达变化;Western blot分析Gardiquimod刺激细胞后,磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K-AKT)信号通路的变化。结果 Western blot和Real-time PCR结果显示:与外周血单核细胞(PBMC)相比,TLR7在Bx PC-3中弱表达;Real-time PCR分析显示:Gardiquimod处理细胞后能刺激细胞中IL-15的表达;TLR7激动剂能够激活PI3K-AKT信号通路。结论 Gardiquimod激活TLR7后能够上调IL-15的表达,并且其激活与PI3KAKT信号途径相关。

Gardiquimod对HepG2细胞中VEGF和TIMP1表达的影响

目的研究Toll样受体7(TLR7)的配体Gardiquimod对HepG2细胞中血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)mRNA表达的影响,并分析其激活的信号通路。方法 HepG2细胞经不同时间的Gardiquimod(2μg/ml)处理后,提取细胞总RNA和总蛋白,RT-PCR分析VEGF和TIMP1转录水平的变化;Western blot分析丝裂原蛋白激活激酶-胞外信号调节激酶(MAPKs-ERK1/2)信号通路,并通过MAPKs-ERK1/2特异性阻断剂PD98059阻断相应的信号途径,进而分析两者的相关性。结果 HepG2细胞中表达TLR7,但较外周血单个核细胞(PBMC)较少。Gardiquimod刺激HepG2 10 min后下调细胞中VEGF mRNA的表达,而刺激细胞30 min后TIMP1 mRNA的表达有明显的上调;Western blot结果显示,细胞中的ERK1/2的磷酸化水平明显降低;并且ERK1/2的特异性抑制剂(PD98059)能有效抑制HepG2细胞中ERK1/2磷酸化作用。结论 TLR7激活能够下调HepG2细胞中VEGF的表达,并与ERK1/2信号通路相关;同时TLR7激活上调TIMP1的表达,但与ERK1/2信号通路无相关性。

Gardiquimod对HaCaT细胞增殖的影响

目的探讨Gardiquimod对HaCaT细胞增殖的影响及其可能的机制。方法培养HaCaT细胞,以不同剂量的Gardiquimod经不同的时间刺激HaCaT细胞,MTT比色法及流式细胞术分析Gardiquimod对HaCaT细胞增殖的影响。Western-blot-ting分析Gardiquimod在HaCaT细胞中激活的信号通路。结果 MTT比色法及流式细胞分析结果显示:Gardiquimod促进HaCaT细胞增殖,且具有时间及剂量依赖性;信号通路分析揭示Gardiquimod能够增加信号通路AKT的磷酸化水平。结论 Gardiquimod能够促进HaCaT细胞增殖并激活PI3K-AKT信号。

TLR7激活对Hela细胞增殖的影响

目的探讨Toll样受体7(TLR7)在Hela细胞中的表达以及激活TLR7后对Hela细胞增殖和MAPKs-ERK1/2及PI3K-AKT两条信号通路的ERK和AKT磷酸化水平的影响。方法采用Real-time PCR分析TLR7在Hela细胞中的表达;使用不同浓度的TLR7激动剂Gardiquimod经过不同的时间刺激Hela细胞,采用MTS比色法分析其对Hela细胞增殖的影响;Western blot分析Gardiquimod对Hela细胞ERK1/2及AKT蛋白磷酸化水平的影响。结果 TLR7在Hela细胞中呈组成性弱表达;TLR7激动剂Gardiquimod可促进Hela细胞的增殖,且呈时间及剂量依赖性;Gardiquimod激活TLR7后可以显著增加Hela细胞中ERK1/2和AKT的蛋白磷酸化水平。结论 TLR7激动剂Gardiquimod能够活化MAPK-ERK1/2和PI3K-AKT信号通路的ERK1/2和AKT蛋白磷酸化水平,并促进Hela细胞的体外增殖。

TLR7激活对HepG2.2.15细胞株炎症因子TNF-α和IL-6表达的上调作用

目的比较乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)基因组稳定转染细胞株HepG2.2.15和肝癌细胞株HepG2中TLR7表达,分析HepG2.2.15细胞中TLR7激活后诱导炎症因子表达。方法通过实时荧光定量(Real-time)PCR分析HepG2和HepG2.2.15中TLR7受体、IL-6和TNF-αmRNA水平表达。TLR7配体Gardiquimod刺激20min后,Western blot分析激活的信号通路;刺激6h,Real-timePCR分析TLR7激活后IL-6和TNF-αmRNA水平表达变化;刺激48h,ELISA法分析IL-6和TNF-α蛋白质水平表达变化。结果HepG2.2.15细胞株中TLR7mRNA水平表达比HepG2中的表达高约30倍(P<0.01)。在没有任何刺激的条件下,HepG2.2.15细胞株中IL-6和TNF-αmRNA水平表达比HepG2中的表达分别高约7.5和9.3倍;Gardiquimod刺激6h后,HepG2.2.15细胞株中IL-6和TNF-αmRNA表达水平明显升高,并具有剂量依赖关系(P<0.01),而HepG2细胞在相同的刺激下IL-6和TNF-αmRNA表达水平升高并不明显(P<0.05);刺激48h后,IL-6和TNF-α蛋白质表达水平变化与其mRNA水平变化一致(P<0.01)。HepG2.2.15细胞株经Gardiquimod刺激后NF-κBp65亚单位进入细胞核中量显著增加。结论TLR7激活后能够上调HepG2.2.15细胞中IL-6和TNF-α的表达,提示TLR7可能在乙型病毒性肝炎的病理生理过程中发挥作用。

Toll样受体7激动剂对K562细胞抑制作用的研究

本研究旨在探讨Toll样受体(TLR)7激动剂gardiquimod对人慢性髓系白血病细胞K562的抑制作用。以异戊烯焦磷酸法扩增人外周血γδT细胞。用不同浓度的gardiquimod处理γδT细胞和K562细胞48 h,用MTT法检测细胞增殖情况。以流式细胞术检测gardiquimod处理前后K562细胞内TLR7表达、细胞周期及凋亡的变化。用CCK-8试剂盒检测γδT细胞对K562的杀伤活性。结果表明,gardiquimod 0.69-11.0μg/ml可明显促进γδT细胞增殖,在5.5-11.0μg/ml浓度下抑制K562细胞增殖;gardiquimod处理K562细胞后未检测到凋亡,但细胞周期有明显变化,而且处理后的K562细胞更易被γδT细胞杀伤。结论:gardiquimod能够抑制K562细胞增殖,阻滞细胞周期,并增强其对γδT细胞杀伤的敏感性。

TLR7激活上调细胞周期蛋白表达促进Hela细胞增殖

目的探讨Toll样受体7(TLR7)信号通路激活对人宫颈癌Hela细胞周期蛋白表达及对细胞增殖的影响。方法使用不同浓度的Gardiquimod经过不同的时间刺激Hela细胞,采用MTS比色法分析其对Hela细胞增殖的影响;采用流式细胞仪检测同一浓度的TLR7激动剂Gardiquimod经过不同的时间刺激Hela细胞后对Hela细胞周期的影响;Western blot分析Gardiquimod经过不同的时间刺激Hela细胞后对细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin E表达水平的影响。结果 TLR7的激活促进Hela细胞增殖,并呈时间和浓度依赖性;Gardiquimod可时间依赖性增加细胞周期在S期的比例;Cyclin B1、Cyclin E的表达水平随着Gardiquimod作用时间的增加而增加。结论 TLR7激动剂Gardiquimod可能通过上调细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin E表达水平,进而促进Hela细胞增殖。

抗CD40抗体增强宫颈癌肽疫苗的治疗作用

目的探讨抗CD40抗体对宫颈癌肽疫苗治疗作用的影响。方法将乳头状病毒结构性蛋白E7表位肽(E749-57,H-2Db限制性,CD8T细胞表位)与Toll样受体7配体(Gardiquimod)组成疫苗,C57BL/6小鼠给予疫苗及抗CD40抗体免疫后取得外周血及脾组织CD8 T细胞,利用流式细胞仪分析特异性CD8 T细胞数量,Elisa检测CD8 T细胞与TC-1细胞(表达HPV E7蛋白的小鼠宫颈癌细胞)共孵育后干扰素(INF-γ)表达水平。另取15只皮下荷瘤小鼠,监测免疫后肿瘤生长速度。结果与单用疫苗组相比,抗CD40抗体明显增加小鼠外周血肿瘤特异性CD8T细胞数量(16.50±0.8185%vs 9.747±1.834%,P=0.0282),且内源性CD8 T细胞体外与TC-1细胞共孵育可以分泌INF-γ,体内显著抑制皮下肿瘤生长(P<0.001)。结论抗CD40抗体增强肽疫苗诱发的免疫应答,有潜力成为一种良好的佐剂。

Toll样受体7激动剂刺激肾癌患者外周血单个核细胞中免疫相关因子表达的实验研究

目的研究肾癌患者中Toll样受体7(TLR7)活化后免疫相关因子的表达变化。方法 2013年6月分离1例肾癌患者外周血单个核细胞(PBMC)并用TLR7特异激动剂Gardiquimod刺激4 h后,用定量聚合酶链式反应方法检测多个免疫相关因子的表达变化。结果 TLR7刺激PBMC后,多个免疫相关因子的表达明显受影响,其中黏附因子的表达均被抑制,多个细胞因子、白细胞介素类因子和趋化因子的表达被明显诱导。结论 TLR7通路活化后可明显增强PBMC中炎症相关因子的表达,具有潜在的临床治疗价值。