天麻抗真菌蛋白基因(gafp)转化彩色棉的研究

天麻抗真菌蛋白 (gastrodiaantifungalprotein简称GAFP)是从我国传统中药天麻 (GastrodiaelataBl.)中分离到的一种具有广谱抗真菌活性的蛋白质 ,它对许多植物真菌病包括棉花枯萎病、黄萎病等的致病菌离体具有很强的抑制作用 ,因此 ,在植物抗真菌病基因工程上有很重要的应用价值。本研究通过花粉管通道法 ,将GAFP的基因gafp转入 3个新疆彩色棉品种中 ,通过田间抗病筛选和分子检测 ,得到了高抗黄萎病的转基因植株 ,两株Southern杂交阳性植株LB_5_8和ZB_1_49对黄萎病表现整株免疫。RT_PCR的结果显示 ,LB_5_8和ZB_1_49中均有gafp的正确转录 ;离体的抑菌实验也表明 ,它们的蛋白粗提物对棉花黄萎病致病菌离体有明显的抑制 ,表明了gafp在转基因植株中的正确表达 ,翻译的产物具有活性。经过进一步选育和扩繁 ,发现转基因彩色棉后代具有稳定的、较强的抗黄萎病能力 ,本研究为通过植物抗病基因工程的方法防治棉花黄萎病提供了一条新的途径。

天麻抗真菌蛋白GAFP-Ⅰ的一级结构和cDNA克隆

天麻抗真菌蛋白ＧＡＦＰ－Ⅰ是从天麻（ＧａｓｔｒｏｄｉａｅｌａｔａＢｌ）顶生球茎分离的１４ｋＤ蛋白，它能强烈抑制腐生真菌菌丝的生长，在天麻限制和防止密环菌（Ａｒｍｉｌａｒｉａｍｅｌｅａ）侵染球茎的防卫机制中起重要作用。本文报告ＧＡＦＰ－Ⅰ的一级结构和ｃＤＮＡ克隆的核苷酸序列。首先测得Ｎ－末端７个氨基酸序列为ＳＤＲＬＮＳＧ－用以合成一个简并引物，由天麻营养球茎提取ＲＮＡ，通过３′－ＲＡＣＥ技术扩增到一个６００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段，直接克隆到ｐＧＥ－Ｔ载体中测定核苷酸序列。根据ｃＤＮＡ核苷酸序列和用羧肽酶Ａ测得ＧＡＦＰ－Ⅰ的Ｃ－末端为－ＡＳＧ，确认该ｃＤＮＡ含有４２９ｂｐ编码区，它编码一条１２９个氨基酸的ＧＡＦＰ－Ｉ和１４个氨基酸的Ｃ－末端扩展肽。同时，分离和纯化ＧＡＦＰ－Ⅰ经过羟胺裂解和α－糜乳胰蛋白酶消化产生的肽段，经自动Ｅｄｍａｎ降解程序测出它们的氨基酸序列。结果表明，由此测出的ＧＡＦＰ－Ⅰ氨基酸序列和由ｃＤＮＡ核苷酸序列推导出的序列９８４％一致。ＧＡＦＰ－Ⅰ由１２９个氨基酸组成，富含Ａｓｎ（１９）、Ｇｌｙ（１４），２９和５２位间有一对双硫键，计算分子量为１３９５８Ｄａ。ＧＡＦＰ－Ⅰ与雪花莲（Ｇａｌａｎ?

天麻抗真菌蛋白GAFP基因转化油葵的研究

以培养6h的油葵自交系6136的子叶为外植体，利用农杆菌介导法将GAFP基因导入该自交系。通过对其遗传转化主要因素的研究，发现将外植体在OD600=0．7的农杆菌中浸泡10—15min后，在含有AS100／μmol／L、pH5．4的预培养培养基上22±1℃暗培养2d，遗传转化率高。研究建立了油葵遗传转化体系，获得了4株经PCR检测为阳性的转基因植株。研究为通过植物抗病基因工程方法防治油葵菌核病提供了1条新的途径。

NP1和GAFP双价抗病基因植物表达载体的构建

防御素对病毒、细菌和真菌都具有一定的抗性。天麻抗真菌蛋白可抑制多种真菌的生长。笔者利用DNA重组技术,将这两个抗病机制不同、抗菌谱均较广的抗病基因(天麻抗真菌蛋白GAFP和防御素NP1基因)构建在一个植物表达载体pBinGAFP-NP1上,为一次性地获得含双价抗病基因的植株奠定了基础。

新疆陆地棉转天麻毒蛋白基因GAFP特性研究

本研究利用花粉管通道技术将在天麻中克隆的天麻毒蛋白基因(GAFP)转化棉花,经PCR和RTPCR鉴定,证实得到了5个转基因株系672GAFP-1,672GAFP-2,672GAFP-3,672GAFP-4,672GAFP-5。通过两年在无病田和病圃中连续种植分析转基因植株抗病性、农艺性状和经济性状的研究,结果表明:外源基因GAFP的导入对棉花农艺性状和经济性状无显著影响;转基因株系672GAFP-1,672GAFP-2,672GAFP-5在病圃中的抗病指数、株高、产量和纤维品质与受体材料672差异显著(P<0.05),产量较对照提高近30%;转基因植株农艺性状和经济性状的各项指标均优于对照,具较强耐枯、黄萎病能力,且能稳定遗传。

双价抗病基因植物表达载体构建及在烟草中表达的初步研究

多基因转化是基因工程研究热点之一。本研究应用DNA重组技术,将两个抗病机制不同,抗菌谱较广的抗病基因(天麻抗真菌蛋白GAFP和兔防御素NP1基因)构建在一个植物表达载体pBin35SGAFP-NP1上,两者具有各自的CaMV35S启动子和Nos终止子。通过根癌农杆菌介导,采用叶盘法转化烟草,PCR和PCR-Southern分析证明已将NP1和GAFP基因整合到烟草基因组中。离体抑菌实验表明转基因植株对真菌和细菌表现出一定的抗性。以上结果表明通过该表达载体进行遗传转化可获得含双价抗病基因植物,并能有效表达,提高转基因植物抗病能力。

转天麻抗真菌蛋白基因提高棉花对黄萎病抗性

黄萎病是全球植棉业的主要病害,严重缺乏抗黄萎病资源导致棉花抗黄萎病育种至今未取得显著进展。采用农杆菌介导法,以下胚轴为受体,将天麻抗真菌蛋白基因转化陆地棉品系苏研060,通过愈伤组织诱导、胚性愈伤组织分化和植株再生,获得大量再生苗。分别以NPT II基因、gafp基因、35S启动子-gafp基因特异引物对再生苗进行PCR检测,将95个阳性再生苗嫁接到海7124幼苗砧木上,获得37个成活植株。RT-PCR检测发现,31个植株出现预期的540 bp扩增片段。盆栽花铃期花粉育性鉴定表明,9个转基因植株雄性败育,22个植株花粉育性正常,通过人工自交得到T1代种子。通过转基因作物隔离区种植、特异引物PCR检测、卡那霉素抗性筛选、自交纯合与选择,培育获得22个T3代转基因纯系。Southern blotting检测发现,转基因植株体内有2个gafp基因拷贝。GAFP蛋白免疫印迹表明,16个转基因纯系出现分子量为14 k D的GAFP蛋白,另6个纯系表现出转录后水平上的基因沉默。黄萎病抗性鉴定结果证实,获得3个抗落叶型黄萎病的棉花株系TG09、TG16和TG23。

天麻中抗真菌蛋白质的诱导和积累

前曾报告从天麻（ＧａｓｔｒｏｄｉａｅｌａｔａＢｌ，）中分离出一种对木霉菌丝生长有强抑制作用的蛋白质，命名为天麻抗真菌蛋白，简称ＧＡＦＰ，也称为Ｇａｓｔｒｏｄｉａｎｉｎ。对不同天麻材料来源的ＧＡＦＰ分析表明：ＧＡＦＰ的相对分子量为１４ｋＤ，等电点可能不同，变动范围８．１—９．３。体外抑菌试验证明ＧＡＦＰ对腐生性真菌如木霉和密环菌等有强抑制活性，半抑制浓度ＩＣ０．５为０．０８ｍｇ／ｍＬ；对寄生性真菌如棉花枯萎病和稻瘟病作用很弱。对球茎生长期中７个阶段ＧＡＦＰ的含量测定和ＧＡＦＰ免疫荧光组织定位观察证明：１．ＧＡＦＰ是营养茎被密环菌侵染诱导而后大量合成的，合成部位可能是大型细胞。２．ＧＡＦＰ由营养茎输送到顶生球茎，积累于皮层细胞中，是皮层细胞的主要蛋白成分。３．营养基衰败后，顶生球茎ＧＡＦＰ的总量下降不多，直至抽苔时转移到花茎中。结果说明ＧＡＦＰ是天麻的一种重要功能蛋白质，是使顶生球茎处于拒菌状态的主要物质。

不同因素对农杆菌介导的杉木转化效率的影响

以杉木试管苗靠近茎尖的茎段为受体材料，研究6个影响杉木遗传转化效果的因素，初步确定杉木茎段较为合适的转化体系为：预培养1—3d，OD600 nm为0．1-0．4的菌液浸染10-15min，共培养3—5d，共培养基附加乙酰丁香酮（AS）80μmol·L^-1，共培养后延迟3d筛选。在初次筛选培养基上共得到186个卡那霉素（Km）抗性芽，在二次筛选培养基上获得39个Km抗性芽。PCR检测有2个Km抗性芽呈稳定阳性，初步证明外源天麻抗真菌蛋白（GAFP）基因已整合到这2个Km抗性芽的基因组DNA中。

两种抗病基因双T-DNA区双元载体的构建

选择标记基因的删除是植物转基因工程中重要的步骤之一,双T-DNA区双元载体转化法以其共整合频率高、删除标记基因效率高的优点在植物遗传转化中应用非常广泛。本文通过构建天麻抗真菌蛋白基因、脂质转移蛋白基因双T-DNA区双元载体,为培育不含选择标记基因的抗病新材料奠定基础。通过PCR的方法克隆GAFP基因,产物纯化测序确定序列准确后与pSB130-35S载体进行BamHⅠ、SacⅠ双酶切;pCAMBIA2300-LTP、pSB130-35S经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切,酶切产物纯化后连接,连接产物转化大肠杆菌。采用基因特异性引物进行菌液PCR鉴定阳性克隆,重组质粒pSB130-GAFP、pSB130-LTP双酶切产物大小分别为540bp、1200bp,与预期产物大小一致,pSB130-GAFP、pSB130-LTP双T-DNA区双元载体构建成功。载体pSB130-GAFP、pSB130-LTP转化根癌农杆菌后可以直接用于植物的遗传转化。

天麻抗真菌蛋白cDNA克隆及植物表达载体的构建

采用RT-PCR技术扩增出天麻抗真菌蛋白(Gastrodia antifungal protein,GAFP)的cDNA序列,通过pGM-T载体转入大肠杆菌JM109克隆,在培养基上筛选重组质粒酶切鉴定,阳性克隆经限制性内切酶Xba1和Sac1酶切与同样酶切的植物表达载体pBI121连接,构建天麻抗真菌蛋白(GAFP)的植物表达载体pBI121-GAFP。结果,天麻抗真菌蛋白(GAFP)的植物表达载体构建成功。