同时鉴别诊断H7亚型和5种NA亚型禽流感病毒GeXP检测方法的建立

目的旨在建立同时鉴别诊断H7亚型及其5种NA亚型(N2、N3、N4、N7和N9)AIV的检测方法。方法针对H7亚型HA基因、5种NA亚型NA基因和所有亚型AIV M基因的保守序列,分别设计了6对亚型特异性引物和1对AIV亚型通用检测引物,利用GeXP多基因表达和毛细管电泳分析技术,建立同时检测H7亚型和5种NA亚型AIV的GeXP高通量分型鉴别诊断方法,对其进行特异性、敏感性和临床样品检测。结果特异性结果显示该法单管可同时检测H7、N2、N3、N4、N7和N9亚型AIV,均能检出对应的亚型AIV,通用检测引物检出所有亚型AIV,与其它常见禽病病原体不存在交叉反应。敏感性结果显示该法对7种AIV目的基因(含H7、N2、N3、N4、N7、N9基因)浓度均为100拷贝/μL时,仍可同时检测出。该法对150份临床样品的检测结果与病毒分离鉴定一致。结论本研究建立的同时鉴别诊断H7亚型和5种亚型AIV GeXP高通量检测方法具有特异性强、敏感性高、快速和简便等优点,为防控AIV提供新型检测方法。

GenomeLab-(TM) GeXP检测rhIL-24联合顺铂对肺癌细胞凋亡相关基因表达的影响

目的探讨重组人白细胞介素24(rhIL-24)联合顺铂(DDP)诱导人肺腺癌A549细胞凋亡相关基因的变化。方法用160 ng/m L rhIL-24、3μg/m L DDP及160 ng/m L rhIL-24联合3μg/m L DDP处理A549细胞,应用Genome LabTMGe XP多基因遗传表达分析系统检测凋亡相关基因Bax、Bcl-2、存活蛋白(survivin)、caspase-3、视网膜母细胞瘤基因(Rb)、p53的mRNA表达水平。结果 rhIL-24蛋白处理的A549细胞上调Bax、caspase-3、Rb的mRNA水平,下调Bcl-2、survivin的mRNA水平,但p53mRNA变化无规律,rhIL-24联合DDP组对A549细胞上述基因表达的影响更明显。结论 rhIL-24蛋白可通过上调Bax、抑癌基因Rb,下调Bcl-2、survivin,激活caspase-3而诱导人肺腺癌A549细胞凋亡。

GeXP多重RT-PCR技术在呼吸道病毒检测中的应用

目的应用GeXP多重基因表达遗传分析系统多重RT-PCR技术检测急性呼吸道感染儿童呼吸道样本中的呼吸道病毒并探讨其在儿童呼吸道感染病毒检测中的价值。方法回顾性检测2010年7月～2012年6月期间因疑似急性呼吸道感染就诊的1800名儿科患者的呼吸道样本，应用GeXP多重基因表达遗传分析系统多重RT-PCR技术对呼吸道合胞病毒、鼻病毒等多种呼吸道病毒进行检测。采用SPSS13．0统计软件进行统计学分析。结果GeXP多重RT—PCR方法检测到样本中的10种呼吸道病毒。样本中共有67．33％（1212／1800）的样本至少有一种病毒检测结果为阳性。这1212份病毒阳性标本中，人类鼻病毒（HRV）阳性最多，为375份，阳性率20．83％；其次为呼吸道合胞病毒（RSV）249份，阳性率13．83％；其他依次为人类腺病毒（HADV）、人类副流感病毒3（HPIV-3）、人类博卡病毒（HBoV）、甲型流感（InfA）、人类副流感病毒4（HPIV-4）、流感C（InfC）、人类偏肺病毒（hMPV）和乙型流感病毒（InfB）；阳性率分别为8．89％，6．5％，5．3％，5．3％，3．3％，1．5％，1．11％和0．67％。不同性别间患儿呼吸道病毒阳性率差异无统计学意义（P〉0．05）。研究中观察到13．5％（243／1800）的病例同时感染两种或两种以上的病毒，其中两种病毒的混合感染为210例（11．67％），3种病毒混合感染为33例（1．83％）。呼吸道病毒的感染率存在季节差异，RSV大多在春季和冬季流行，HBoV，hMPV，InfA，InfB和HPIV-3大多是在春季流行，而HADV和HPIV-4主要在夏季流行，InfC大多是在秋季流行。结论GeXP分析系统多重RT-PCR方法是一个快速、高通量、高灵敏度且特异度强的检测分析方法，可用于急性呼吸道感染临床分子诊断和流行病学研究。

应用GeXP遗传分析系统检测病毒性脑炎患儿脑脊液中的人类鼻病毒

目的探讨儿童脑炎与鼻病毒的关系以及GeXP多重基因表达遗传分析系统在病毒性脑炎患儿脑脊液人类鼻病毒检测方面的应用价值。方法选择2012年1-12月因发热抽搐等症状就诊于汕头大学医学院第二附属医院儿科重症监护室的患儿脑脊液140份,应用GeXP遗传分析系统对脑脊液标本进行包括人类鼻病毒在内的常见呼吸道病毒筛查,巢式RT-聚合酶链反应（PCR）扩增鼻病毒阳性标本,并对扩增产物进行核酸序列测定和同源性比对。结果 GeXP遗传分析系统共检测出6份鼻病毒阳性标本,经巢式RT-PCR扩增、核酸序列测定和同源性比对,结果为鼻病毒C型4份,与GenBank数据库参考序列同源性为95.8%-98.3%。鼻病毒A型和B型各1份,与参考序列同源性分别为96.0%和99.0%。结论鼻病毒是引起儿童脑炎的病原之一,GeXP遗传分析系统为病毒性脑炎的病原学研究提供快速高通量的检测。

同时监测8种牛常见病原体的GeXP高通量快速检测技术

本研究旨在建立一种可同时检测8种常见牛传染病病原体(口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水疱性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、产肠毒大肠杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒和小反刍兽疫病毒)的GeXP高通量快速检测方法。将多重PCR技术和毛细管电泳技术有效地结合,根据上述8种病原体的基因保守序列,设计并合成了8对特异性引物,在每对特异性引物的5′端加上一段通用引物,形成特异性嵌合引物。优化反应体系和反应条件,用单一病毒和混合病毒样品来验证所建立的GeXP方法的特异性,用克隆质粒稀释液来测试GeXP方法的灵敏度,检测305份临床样品,进一步验证该方法的可靠性。结果:优化后的GeXP检测体系,可扩增出各病原体对应的特异片段,能在100拷贝·μL^(-1)水平同时并特异地检测出8种牛病病原体核酸。305份临床样品的检测结果与荧光PCR检测结果一致,阳性样品测序结果表明无非特异性扩增的假阳性。结果显示,所建立的GeXP方法具有高通量、特异性好、灵敏度高、方便快速等优点,可用于临床鉴别诊断和流行病学调查,具有较高的临床应用价值。

肉及肉制品中6种致病菌的GeXP多重PCR检测

利用多重基因表达(GenomeLabTM eXpress Profiling,GeXP)遗传分析系统建立一种可单管一次同时检测大肠杆菌O157∶H7、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特菌和沙门氏菌6种肉及肉制品中致病菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。评价此方法特异性和灵敏性,并初步应用于市场随机购买的肉类样品的检测。结果显示,该方法可在短时间内实现同时对上述6种致病菌进行检测,且检测灵敏度低至103 CFU/mL,为食源性致病菌高通量快速有效检测提供新的方法技术支持,具有较强的实际应用价值。

GeXP检测rhIL-24联合DDP对人肺腺癌A549/DDP细胞凋亡相关基因的实验研究

目的:利用多基因遗传表达分析系统(GeX P)探讨重组人白细胞介素-24(rhI L-24)联合顺铂(DDP)诱导人肺腺癌顺铂耐药株A549/DDP细胞6个凋亡相关基因的变化。方法:用rhI L-24、DDP及rhI L-24+DDP干预A549/DDP细胞,应用多基因遗传表达分析系统(GeX P)同时检测Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase3、Rb与P53等6个凋亡相关基因。结果:rhI L-24蛋白可引起A549/DDP细胞Bax基因、Caspase3基因、Rb基因转录上调;Bcl-2基因、Survivin基因转录下调,但抑癌基因P53变化无规律,rhI L-24联合DDP后Bax、Survivin、Rb表达较单独rhI L-24组变化更加显著。结论:rhI L-24蛋白可通过上调Bax,下调Bcl-2、Survivin,激活Caspase3,上调抑癌基因Rb诱导人肺腺癌A549/DDP细胞凋亡。

7种猪场常见高致死病原GeXP检测方法的建立

本研究旨在建立能同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、坏死梭杆菌(Fn)和副猪嗜血杆菌(Hps)7种猪场常见高致死性流行病原的多重PCR检测方法。利用7种病原体的保守序列设计7对特异性引物,同时合成了Cy-5标记的通用引物。将通用引物分别连接到特异性引物的5′端形成7对特异性嵌合引物。优化反应条件,分别使用7组嵌合引物和通用引物混合,扩增7种病原的混合cDNA/DNA,验证其单重PCR的特异性。利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,混合7种嵌合引物和通用引物,扩增单一病原的cDNA/DNA,验证其多重PCR特异性;将其他常见猪病病原的基因组作为干扰的阳性标本,利用7对混合嵌合引物和通用引物进行多重PCR分析,扩增加入了阳性标本的混合模板,验证其多重PCR的抗干扰能力。利用重组质粒和体外转录的RNA进行梯度稀释,确定GeXP多重检测体系的灵敏度。结果表明,7种不同引物分别进行GeXP单重及多重检测,均能检测出特异性目的片段的信号,无明显的干扰片段信号出现;GeXP多重检测抗干扰试验结果显示,在混入3种干扰病原模板后,依然可同时特异性检测出7种病原;GeXP多重检测灵敏度分析显示,在10~3拷贝/μL浓度条件下能检测到7种不同基因的特异性结果。本研究建立的同时检测7种猪场常见高致死性流行病原的GeXP检测方法具有高通量、高特异性和高灵敏度的特点,为快速诊断猪流行性疾病的交叉感染和混合感染提供了新型的检测方法。

GeXP多重分析技术检测肝癌组织长链非编码RNA表达的实验研究

目的运用多重基因表达遗传分析系统(genomelab gene expression profiler,Ge XP),创建一种能同时检测肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织长链非编码RNA(long non-coding RNA,Lnc RNA)表达的一种多重逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RTPCR)检测方法,为HCC的诊断及预后提供一定的方法学基础。方法检索并筛选Pubmed数据库中近10年发表的与HCC有关报道的8种Lnc RNAs,并分别设计特异性引物。首先验证引物及多重反应体系的特异性及灵敏性,经过系统优化后建立一种多重RT-PCR检测方法。另检测23对HCC肿瘤组织和癌旁非肿瘤组织标本,并用实时定量PCR技术(quantitative real-time PCR,q PCR)来验证检测体系并进行结果统计。结果优化后的Ge XP多重检测体系,特异性及灵敏性良好。另在23对HCC肿瘤组织及癌旁组织中检测到了这8种Lnc RNAs的差异表达:与癌旁组织相比,HCC组织中Lnc RNA NEAT1、H19、MALAT1、HOTAIR、DANCR、UCA1、BCAR4的表达显著下降(P均<0.05);肝癌组织中Lnc RNA GAS5的表达显著上升(P<0.05)。q PCR方法验证与Ge XP方法结果一致。结论应用Ge XP多重分析技术成功建立了一种于单管中同时检测HCC组织8种Lnc RNAs表达的检测方法,该方法有效、快捷、灵敏、特异,对HCC的诊断及预后具有启示作用并奠定了一定的方法学基础。

8种猪呼吸道和繁殖障碍病病原体GeXP检测方法的建立

【目的】建立了一种同时鉴别H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎、猪圆环病毒病、猪细小病毒病和猪伪狂犬病8种病毒性呼吸道和繁殖障碍病病原体的GeXP高通量检测方法。【方法】根据这8种病原体的基因保守序列,设计并合成了9对特异性引物,在每对特异性引物的5＇端均加上一段通用引物,形成特异性嵌合引物。运用GeXP单重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA为模板验证引物的可行性;建立GeXP多重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA模板、阳性cDNA/DNA混合模板验证GeXP多重检测体系的特异性和准确性;将含猪圆环病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒靶基因的克隆质粒及体外转录的RNA（H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎）分别梯度稀释为10^3,10^2,10^1拷贝/μl,运用GeXP多重PCR方法进行单一病原体灵敏度分析;根据单一病原体的灵敏度分析结果,优化各对特异性嵌合引物的工作浓度,将含有体外转录好的6种RNA模板和3种克隆质粒等量混合,将混合物梯度稀释为10^4,10^3,10^2,10^1拷贝/μl,运用GeXP多重PCR方法分析同时检测8种病原体的灵敏度。运用建立好的GeXP多重检测体系对23份临床样品进行检测,并与常规单重PCR进行比较,对该GeXP多重检测体系的临床应用进行评价。【结果】基于GeXP系统的单重PCR检测体系和GeXP多重PCR检测体系均能扩增出特异性片段,验证了引物的可行性、GeXP多重检测体系的特异性和准确性;GeXP多重检测体系的单一病原模板灵敏度分析结果显示,多重检测体系对单一病原体检测的下限均为10-1拷贝/μl;GeXP多重检测体系在8种病原体同时检测的灵敏度分析结果显示,多重检测体系可在10^3拷贝/μl水平可同时检测到8种病原体;比较GeXP多重PCR检测方法和常规PCR方法对临床样品的检测结果,两种检测方法的检测结果相符。【结论】成功建立了基于GeXP系统的多重PCR检测体系,可以同时检测8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体;本研究建立的同时鉴别8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体的GeXP检测方法具有高通量、特异性强和灵敏度高的特点,为猪病毒性呼吸道和繁殖障碍性疾病的分子诊断提供了新型的检测方法。

9种鸭病毒病GeXP多重PCR检测方法的建立及其应用

旨在建立一种能够同时鉴别H5、H7和H9亚型禽流感病毒、基因A型鸭甲肝病毒、鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒、减蛋综合征病毒、新城疫病毒、鸭圆环病毒、番鸭呼肠孤病毒和番鸭细小病毒9种常见鸭病毒病的GeXP多重PCR检测方法。根据这些病原体在GenBank上公布的保守基因序列,设计合成了12对特异性GeXP引物。用单一病毒或混合病毒样品的cDNA/DNA模板优化反应条件,同时以其他常见鸭病病原体及鸭组织器官核酸为对照,验证所建立的GeXP方法的特异性和准确性。以106至101拷贝·μL-1梯度稀释的克隆质粒或体外转录RNA来检测GeXP方法的敏感性。随机选取不同浓度的模板(103和107拷贝·μL-1)进行干扰性试验,并与单一病原体为模板的GeXP多重PCR的检测结果比较。最后用该方法检测150份临床样品,与普通PCR方法的结果作比较,所有阳性结果样品均进行测序,进一步验证所建立的GeXP检测方法的可靠性。结果显示,单重或多重模板的GeXP检测均能特异性扩增出相应片段,不能扩增其他常见鸭病病原体,并且可在103拷贝·μL-1水平上同时特异地检测出9种鸭病原体。GeXP干扰性试验结果显示,当3种不同浓度的模板组合时,本试验所建立的方法依然可同时检测出所有病原体,与单重检测比较,未影响其检出。比较GeXP多重PCR方法和普通PCR方法对150份临床样品的检测结果,结果显示GeXP方法更为敏感与准确。笔者建立的同时鉴别9种鸭病毒病的GeXP多重PCR检测方法,具有高通量、特异性强和灵敏度高的特点,为混合感染的鸭病毒病临床样品提供了快速分子诊断新方法。

应用多重GeXP-PCR同时检测6种鸡免疫抑制病病毒的研究

拟建立一种基于GeXP多基因表达分析系统的多重PCR方法,同时检测6种鸡免疫抑制病病毒——鸡马立克病毒、禽白血病病毒(包括A、B和J亚群)、禽网状内皮组织增生症病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性贫血病毒和传染性法氏囊炎病毒。多重PCR反应使用嵌合引物和通用引物组合的反应体系,经过GeXP多基因表达分析系统进行毛细管电泳,鉴别PCR产物片段;通过调整嵌合引物浓度、Mg^(2+)浓度、Taq酶浓度优化反应体系及调整退火温度和时间优化反应条件。应用建立的多重GeXP-PCR,分别单独和同时检测6种鸡免疫抑制病病毒的8个目的基因,同时以其他常见禽类病毒和鸡组织器官核酸为对照,验证其特异性;检测8个目的基因不同浓度的克隆质粒,验证其敏感性;应用建立的多重PCR检测300份临床样品,并同时用荧光定量PCR和测序验证其检测结果的准确性。结果表明建立的多重GeXP-PCR方法能够分别扩增出6种病毒,8个特异性目的片段,不能扩增其他常见禽类病毒和鸡组织器官的基因;在低至100copies·20μL^(-1)的水平能同时特异性地检测出6种鸡免疫抑制病病毒核酸;检测300份临床病死鸡样品,190份样品显示为阳性,PCR和测序结果与多重GeXP-PCR结果相符。本研究建立的多重GeXP-PCR方法可特异、敏感、高通量地检测6种鸡免疫抑制性病毒,可用于临床鉴别诊断和分子流行病学调查,具有很高的临床应用价值。

7种食源性致病菌GeXP多重PCR检测方法的建立及其应用

本研究旨在建立一种能够同时鉴别包括大肠杆菌O157:H7、沙门菌、空肠弯曲菌、单核细胞增生李斯特菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌7种常见食源性致病菌的GeXP多重PCR检测方法。根据这些致病菌在GenBank上公布的保守基因序列,设计合成了7对特异性GeXP引物。用单一或混合细菌样品的DNA模板优化反应条件,设置对照组,构建重组质粒,随机组合不同浓度的样品,验证所建立的GeXP方法的特异性、敏感性和准确性。最后用该方法检测120份临床样品,进一步验证所建立的GeXP检测方法的准确性和可靠性。结果显示,单一或混合模板的GeXP检测均能特异性出现相应清晰峰值,可在10~3拷贝·μL^-1水平上同时特异地检测出7种细菌病原体,不同浓度模板混合时,本试验所建立的方法依然可检测出对应病原体。检测120份临床样品,GeXP多重PCR阳性率为2.50%(3/120)~15.83%(19/120),普通PCR阳性率为2.50%(3/120)~15.00%(18/120),GeXP多重PCR多检出8份阳性,表明GeXP方法更为敏感与准确。本研究建立的同时鉴别7种食源性致病菌的GeXP多重PCR检测方法,具有高通量、特异性强和敏感性高的特点,为食源性常见致病菌感染或混合感染提供了快速分子诊断方法。

多重基因分析系统检测幽门螺杆菌的初步研究

目的评估一种全新的幽门螺杆菌(HP)检测方法,即利用多重基因分析系统(GeXP系统)检测HP感染。方法分别用培养法、快速尿素酶法、普通聚合酶链反应(PCR)和多重基因检测法检测胃活检组织标本中的HP,用Stata 12.0统计软件评估各种方法的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值,从检测方法角度横向评估多重基因法检测HP的有效性;选取16S rRNA、ureA、ureC、26KDa、cagA基因作为HP的诊断基因并做多重基因检测,从多重基因检测角度纵向评估GeXP系统检测HP感染的有效性。结果培养法的敏感性为76.8%,特异性为100.0%,阳性预测值为100.0%,阴性预测值为57.7%;快速尿素酶法的敏感性为87.8%,特异性为80.8%,阳性预测值为93.5%,阴性预测值为67.7%;普通PCR的敏感性和特异性最高,均为100.0%。GeXP系统敏感性和特异性分别为100.0%和71.3%,阳性预测值为90.9%,阴性预测值为100.0%。结论初步建立的诊断HP感染的多重基因检测法(GeXP系统)具有高敏感性、高特异性以及高通量的特点,不仅可以满足临床标本检测的需求,还可以进行根除治疗后的预后监测,具有很高的临床应用价值。

BCL6、KLF5、NCL基因在儿童急性淋巴细胞白血病中异常表达的特点

目的:研究转录因子基因BCL6、KLF5及核仁蛋白基因NCL在急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)患儿骨髓细胞中的表达情况及其在不同疾病状态下的表达特点。方法:选取北京儿童医院2004年1月至2005年12月住院ALL患儿100例,另取由于骨骼畸形而在北京儿童医院进行外科手术的5例非ALL患儿作对照;以基因芯片检测ALL患儿骨髓细胞中异常表达基因,GeXP多重基因表达分析系统检测BCL6、KLF5、NCL基因在另外选取的10例配对ALL患儿初诊及缓解期的表达变化。结果:基因芯片筛查发现,在100例各亚型ALL标本中,BCL6和KLF5mRNA表达均下调,NCLmRNA表达均上调。BCL6和KLF5mRNA在10例ALL初诊患儿骨髓细胞中表达较低,完全缓解后表达升高(0.380±0.16vs0.850±0.10,0.074±0.021vs0.228±0.049;均P<0.01);NCLmRNA在ALL初诊患儿骨髓细胞中表达较高,完全缓解后表达降低(0.234±0.054vs0.151±0.055,P<0.01)。在10例配对患者儿中,TEL-AML1阳性及E2A-PBX1阳性组患儿的初诊及缓解期骨髓细胞中,该3个基因在两组中的表达变化趋势一致。结论:ALL患儿骨髓细胞中BCL6、KLF5基因在初诊时表达下调、在临床缓解后表达上调,NCL基因初诊时上调、临床缓解后下调;该3个基因似可作为白血病的分子标志物及效疗的监测指标。

多基因遗传表达分析系统检测rhIL-24诱导人卵巢癌细胞凋亡相关基因的应用

目的:探讨重组人白细胞介素24(recombinant human interleukin-24,rhIL-24)诱导人卵巢癌SKOV3细胞株、SKOV3/ddp人卵巢癌耐顺铂细胞株的凋亡相关6个基因表达的变化。方法:体外培养人卵巢癌SKOV3细胞株、人卵巢癌耐顺铂SKOV3/ddp细胞株,用rhIL-24单独及其联合顺铂作用于两种不同的细胞株,提取RNA,经逆转录和聚合酶链反应,应用多基因遗传表达分析系统(GeXP)同时检测6个凋亡基因。结果:rhIL-24诱导上调人卵巢癌SKOV3细胞株Bax、Rb、P53基因,激活Caspase-3,下调Bcl-2、Birc5基因;rhIL-24诱导上调人卵巢癌耐顺铂SKOV3/ddp细胞株Bax、Rb基因,激活Caspase-3,下调Bcl-2基因;rhIL-24联合DDP组其上述基因表达变化更加显著。结论:rhIL-24诱导人卵巢癌细胞凋亡主要通过上调Bax、Rb、P53,激活Caspase3,下调Bcl-2,Birc5等凋亡相关基因。

毛白杨纤维素合酶基因家族部分成员的克隆及表达

从毛白杨中分离7个纤维素合酶基因,分别为PtoCesA4,PtoCesA5,PtoCesA7,PtoCesA8,PtoCesA13,PtoCesA17和PtoCesA18,通过与已公布的毛果杨全基因序列及拟南芥和水稻基因组中纤维素合酶基因序列的同源性比对分析,结合目前纤维素合成机制的研究进展,预测毛白杨中上述不同纤维素合酶的功能。利用GenomeLabTMGeXP遗传分析系统分析毛白杨中纤维素合酶基因在不同组织中的转录表达水平,结果表明PtoCesA4,PtoCesA7,PtoCesA8,PtoCesA17和PtoCesA18在木质部高丰度表达,推测这些基因可能参与毛白杨次生细胞壁的形成,为毛白杨次生细胞壁中纤维素的合成调控提供参考依据。

外周血多参数基因诊断模型对于原发性肝细胞癌诊断价值的评价

目的建立一种基于外周血mRNA的原发性肝细胞癌多参数基因诊断模型。方法 GeXP法检测9个基因(GPC3、HGF、ANXA1、FOS、SPAG9、HSPA1B、CXCR4、PFN1和CALR)的含量。103例早期原发性肝癌患者和54例健康对照人群用于建立诊断模型。52例早期原发性肝癌患者和34例健康对照人群用于验证模型。使用二元Logistic回归分析、判别分析、分类树和人工神经网络建立多参数基因诊断模型用于评价其诊断价值。受试者工作曲线、曲线下面积、敏感性和特异性用于诊断价值的评价。结果 9个基因的人工神经网络模型具有最好的诊断价值,其曲线下面积、敏感性和特异性分别为0.943,98%和85%。验证后,其敏感性和特异性分别为96%和86%。结论多参数基因诊断模型的诊断价值优于单一基因诊断价值,可以作为潜在的早期原发性肝癌辅助诊断方法。

引物标记技术在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测中的应用

目的在GeXP系统中应用CY5标记的特异引物代替通用引物,建立一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法。方法设计mecA与nuc基因引物,经聚合酶链反应(PCR)扩增琼脂糖电泳验证引物特异性并优化PCR反应条件。用荧光染料CY5标记单条引物(单独标记上游或下游引物)。以提取的MRSA、甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)核酸为模板液,采用已标记引物进行单重及多重PCR,产物经琼脂糖电泳与GeXP毛细管电泳分析,验证应用效果。再通过采用混合标记引物的GeXP系统检测100株MRSA,分析其应用效果。结果单标记下游引物的GeXP-PCR的杂质扩增峰较少。经GeXP系统检测分析的MRSA、MRCNS、MSSA均出现目的特征峰,能明确辨别其含有大小不同的基因片段,结果与琼脂糖电泳一致;经GeXP系统分析的100株MRSA均含有nuc与mecA片段,与VITEKⅡCompact检测结果相符。结论单独标记下游引物应用于GeXP检测MRSA的方法可行。

引物标记技术的应用与葡萄球菌多重耐药基因检测法的建立

目的基于多重基因遗传信息表达分析系统(Ge XP)技术平台,应用CY5(荧光染料)标记的特异引物代替通用引物,建立一种高通量的葡萄球菌多重耐药基因检测法。方法设计细菌16S rDNA、耐甲氧西林相关基因(mecA、MecA LGA251)与耐大环内酯类相关基因(ermA、ermB、ermC、sat4、msrA、ereA、ereB、mefA/E)的引物,经"PCR+琼脂糖电泳"筛查2014年1月—2016年12月中山大学附属第八医院129株耐甲氧西林或者耐红霉素葡萄球菌基因,同时优化PCR。用CY5标记上游引物5'端,制作Ge XP多重PCR引物。应用多重PCR扩增多重耐药基因核酸,产物经琼脂糖电泳与Ge XP毛细管电泳,分析电泳图优化PCR。应用优化后的Ge XP多重PCR扩增43株葡萄球菌,验证应用效果。结果 129株葡萄球菌筛出7种基因(16S rDNA、mecA、ermA、ermB、ermC、sat4和msrA)。16S rDNA、mecA、ermA、ermB、ermC和msrA引物特异性好,但不同核酸的sat4基因能扩增出两种不同大小片段。建立的Ge XP多重PCR能同时检出所有靶基因。43株葡萄球菌的检测结果与表型检测(VITEKⅡCompact System)相符;与"PCR+琼脂糖电泳"相比:sat4符合率为97.67%(42/43),无统计学差异(P>0.05);msrA符合率为95.35%(41/43),无统计学差异(P>0.05);ermA、mecA、16S rDNA、ermB和ermC符合率均为100%(43/43)。结论采用CY5标记特异引物应用于GeXP系统检测葡萄球菌多重耐药基因的方法可行,其特异性与敏感性高,若采用更多引物,其检测通量可进一步提高。