钩吻素子体外诱导人结肠腺癌LoVo细胞凋亡的实验研究

目的探讨钩吻素子(Kou)体外能否诱导LoVo细胞凋亡。方法以Kou(50 μmol/L)作用于LoVo细胞,经光镜、电镜和荧光显微镜观察细胞凋亡情况,并用流式细胞仪检测细胞增殖周期状态。结果通过光镜、电镜和荧光显微镜观察均证实Kou可诱导LoVo细胞凋亡,且凋亡百分率随Kou作用时间的延长而升高。经Kou作用后的肿瘤细胞,细胞周期状态发生明显变化,G0/G1期细胞从31.3%上升到42.3%,S期细胞从62.0%下降到38.7%。结论Kou可诱导LoVo细胞凋亡,且存在时间依赖关系,Kou可抑制细胞DNA的合成,阻止细胞由G1期向S期转化。

钩吻总生物碱中钩吻素子的提取与分离

目的研究钩吻中总生物碱的提取、总量测定方法及其中主要成分钩吻素子的分离、鉴定方法。方法采用加热回流提取与氯仿萃取相结合的方法提取总生物碱;采用碱性硅胶柱层析、梯度洗脱法分离钩吻素子并用薄层层析法和紫外分光光度法定性鉴别。结果从钩吻中分离得到了无色棱柱状钩吻素子晶体。结论本实验所采用的提取钩吻总生物碱及分离钩吻素子的方法行之有效。

钩吻生物碱成分的薄层色谱研究

目的对钩吻根、茎、叶、花、果实生物碱进行薄层色谱研究。方法以钩吻碱甲和钩吻素子为对照,对不同产地钩吻的根、茎、叶、花、果实生物碱进行薄层色谱研究,考察了5种提取方法、4种展开系统、5种薄层板、3种检视方式以及不同温度和湿度对钩吻生物碱薄层色谱的影响。结果以方法 5提取,过PXC柱(阳离子交换树脂),以三氯甲烷-甲醇(9∶1)为展开系统,稀碘化铋钾试液-10%三氯化铁乙醇溶液(10∶1)混合溶液为显色剂,钩吻生物碱薄层色谱信息保留较多,分离较好,薄层效果最佳。结论该方法可作为鉴别钩吻的较专属鉴别方法。

钩吻素子在大鼠体内的药物代谢动力学及组织分布

目的建立HPLC测定大鼠血液和组织钩吻素子含量的方法,进而研究单次灌胃给予钩吻素子的大鼠体内药动学以及组织分布。方法采用萃取法预处理大鼠的血液和组织样品;建立HPLC-紫外检测法测定生物样品的钩吻素子含量。大鼠单次灌胃给予钩吻素子15mg/kg后,于不同时间点收集血液和组织样本,HPLC法测定大鼠血浆和组织中的钩吻素子含量,计算药代动力学参数。结果建立的HPLC测定血液和组织钩吻素子含量的方法,专属性好,线性范围分别为0.06～10.00μg/mL和0.08～5.00μg/mL,日内和日间RSD均<9%,提取回收率分别为80.03%～83.55%和64.20%～76.82%,方法回收率分别为99.21%～110.36%和91.87%～109.25%。雄性SD大鼠单次灌胃给予15mg/kg钩吻素子,达峰时间为(19.95±0.53)min,消除半衰期为(234.11±17.37)min,表观分布容积为(10.45±0.36)L/kg,曲线下面积为(142.35±5.86)mg·min·L-1。给药5min后,待检组织均检出钩吻素子,且多数组织浓度已达峰,组织浓度在胃、体脂、肝、肾、脾、小肠较高;随后,多数组织中的药物含量随时间推移而下降,但肝脏和小肠含量在给药后15min最高;给药60min后多数组织药物含量较低,其中骨骼肌和睾丸已低于检测限。结论本HPLC测定生物样品钩吻素子含量的方法操作简便,准确灵敏,可用于钩吻素子体内药动学研究;钩吻素子在大鼠体内的药代动力学符合二室模型;钩吻素子在大鼠体内分布迅速广泛,以消化道浓度为高,可透过血脑屏障,消除速度快。

RP-HPLC法测定钩吻生物碱

用RP-HPLC法分离和测定了钩吻碱甲(G),钩吻碱戊(F),胡蔓藤碱丙(D)、胡蔓藤碱乙(B)及胡蔓藤碱甲(A)。用常山碱为内标。分析柱C_(18),甲醇—水—正丁胺(78:22:0.1 V/V)为流动相,流速1.0 ml/min,检测波长256 nm。线性范围0.02～0.12μg,相关系数r=0.9835～0.9977,回收率95.01～99.70%。本方法简便、灵敏、重现性好,为生产及临床用药提供质量控制依据。

高速逆流色谱分离制备钩吻素子

目的建立应用高速逆流色谱技术分离纯化中国钩吻中钩吻素子的方法。方法从中国钩吻中提取得到的钩吻总碱以氯仿-甲醇-0.1 mol/L HC(l4∶4∶2,V/V/V)为溶剂体系,通过高速逆流色谱进行分离,得到的目标单体采用高效液相色谱分析纯度,核磁共振谱氢谱、质谱分析确证化学结构。结果进样300 mg钩吻总碱,分离得到生物碱单体为75 mg,经结构鉴定确证为钩吻素子,高效液相色谱分析得到质量分数为99.2%。结论高速逆流色谱技术可高效分离纯化钩吻素子。

钩吻素子无吗啡样药物依赖性

目的评价钩吻素子产生吗啡样药物依赖性的潜力。方法采用离体豚鼠回肠药物依赖模型、小鼠药物依赖催促戒断模型和自然戒断模型,分析钩吻素子诱导吗啡样身体依赖性的潜力;进而通过小鼠条件性位置偏爱实验评价钩吻素子诱导吗啡样精神依赖性的潜力。结果钩吻素子孵育的离体豚鼠回肠未出现吗啡样纳洛酮催促的戒断反应;小鼠连续给予钩吻素子,未出现吗啡样纳洛酮催促的跳跃、体质量下降和自然戒断的体质量下降等戒断反应;也未见吗啡样条件性位置偏爱效应。结论钩吻素子可能无吗啡样药物身体依赖性和精神依赖性的潜力。

钩吻素子抗外周神经损伤致神经病理性疼痛中自发痛的效应

目的观察钩吻素子抗外周神经损伤致神经病理性疼痛(NPP)中自发痛的效应。方法在大鼠坐骨神经慢性束缚损伤(CCI)NPP模型上,以术侧自发性抬足时间和足姿势评分为指标,观察单次(7.0,1.4,0.28mg/kg)、连续多次(7.0,0.28mg/kg,每日2次,连续7d)皮下注射给予钩吻素子对NPP中自发痛的效应。结果单次皮下注射给予钩吻素子剂量依赖性减少自发性抬足时间,其中7.0mg/kg组与对照组比较差别有统计学意义(P<0.01);单次皮下注射给予钩吻素子剂量依赖性降低足姿势评分,其中1.4,7.0mg/kg组与对照组比较差别有统计学意义(P<0.05和P<0.01)。连续多次给予钩吻素子减少自发性抬足时间,7.0mg/kg组在术后第3,5,7,9d自发性抬足时间均低于对照组(P<0.01);连续多次给予钩吻素子降低足姿势评分,7.0mg/kg组在术后第3,5,7,9d评分均低于对照组(P<0.05或P<0.01),到术后第9d疗效最强。结论钩吻素子具有抗外周神经损伤致NPP中自发痛的效应。

钩吻素子抗外周神经损伤导致诱发痛的效应

目的：观察钩吻素子抗外周神经损伤致神经病理性疼痛中诱发痛的效应及其时效关系，分析脊髓是否为钩吻素子抗神经病理性疼痛的可能作用部位。方法在大鼠坐骨神经慢性束缚损伤（CCI）致神经病理性疼痛模型上，以热痛觉过敏为指标，观察连续皮下注射给予钩吻素子（0．28、7．0mg/kg，CCI术后第3～9d，每天2次）对CCI大鼠诱发痛的效应；观测单次皮下注射给予7．0mg/kg钩吻素子后第0．5，1，2，4，6h对CCI大鼠诱发痛的效应及时效关系；Dixon序贯法分别测定钩吻素子皮下和鞘内注射抗CCI大鼠诱发痛作用的ED50，分析脊髓是否为钩吻素子抗神经病理性疼痛的可能作用部位。结果连续皮下注射7．0mg/kg钩吻素子组在术后第3d首次给药后，痛阈即显著高于溶剂对照组，术后第9d效应最显著（翻转率为93．8％，有效率达100％）。单次皮下注射给予7．0mg/kg钩吻素子0．5h术侧足痛阈显著高于溶剂对照组（翻转率达62．9％，有效率达55．6％）；1h痛阈最高（翻转率达70．8％，有效率达77．8％），随后痛阈有所下降，但6h仍显著高于CCI＋saline组。单次皮下注射钩吻素子抗CCI大鼠诱发痛作用的ED50为1．074mg/kg，单次鞘内注射的ED50为每只41．4μg，远低于皮下注射的ED50。结论钩吻素子具有抗外周神经损伤致神经病理性疼痛中诱发痛的效应，单次给予0．5h内起效，持效约5．5h；脊髓可能是其发挥抗神经病理性疼痛效应的作用部位。

钩吻生物碱化合物抗肿瘤效应及其诱导凋亡作用

目的研究钩吻生物碱化合物抗肿瘤效应及其诱导凋亡作用。方法 1在小鼠H22肝癌细胞小鼠移植性肿瘤模型上观察钩吻生物碱化合物对H22小鼠实体瘤的抑制作用;2AO/EB荧光染色法观察凋亡细胞的形态学变化;流式细胞仪PI染色检测细胞周期变化及凋亡率。结果腹腔注射钩吻素子对H22小鼠实体瘤的抑瘤率为40.29%、36.57%、22.89%;钩吻素甲对小鼠H22实体瘤的生长具有一定的抑制作用,抑瘤率为28.91%、16.85%、9.68%;但1-甲氧基钩吻碱小鼠H22实体瘤没有明显的抑制作用。钩吻素子可诱导SW480细胞发生凋亡形态学改变,并且可使SW480细胞周期阻滞于S期,阻止细胞从S期至G2期转移,从而诱导其凋亡。结论钩吻生物碱化合物特别是钩吻素子具有较强的抗肿瘤活性并具有一定的构效关系,钩吻素子的抗肿瘤作用机制可能与阻滞肿瘤细胞周期和促进肿瘤细胞凋亡作用有关。

HPLC法同时测定钩吻提取物中3种生物碱的含量

目的建立HPLC同时测定钩吻提取物中钩吻素子、钩吻素甲及16-表伏康树卡平碱3种生物碱含量的方法。方法采用YMC C_(18)(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,以乙腈和0.025 mol·L^(-1)磷酸二氢钾(磷酸调pH至3.0)水溶液进行梯度洗脱;检测波长为254 nm,柱温30℃进样量10μL,流速1.0 mL·nin^(-1)。结果钩吻素子、钩吻素甲和16-表伏康树卡平碱质量浓度分别在32.2~322、34.4~344、6.2~62μg·m^(-1)内与峰面积呈良好的线性关系,加样回收率分别为98.6%、101.1%、98.3%,RSD分别为1.7%、1.3%、1.1%。结论该方法准确、简便、重现性好,可用于钩吻提取物中钩吻素子、钩吻素甲及16-表伏康树卡平碱的含量测定。

钩吻素子亲水凝胶骨架缓释片的处方优化及其体外释放度研究

目的优化筛选钩吻素子亲水凝胶骨架缓释片处方,并考察其体外释药行为。方法以羟丙甲基纤维素(HPMC)为缓释骨架材料,以累积释放度为指标,采用正交试验优化制剂处方;采用粉末直接压片法制备钩吻素子亲水凝胶骨架缓释片,并对缓释片体外释药行为进行考察。结果钩吻素子亲水凝胶骨架缓释片优化处方为:钩吻素子10mg,HPMC K4M112mg,乳糖22.4mg,预胶化淀粉132.8mg,微粉硅胶1.4mg,硬脂酸镁1.4mg;以此法制备的缓释片2h内钩吻素子释放度为35%～40%,6h内释放度为60%～65%,12h内释放度为90%以上;钩吻素子亲水凝胶骨架缓释片体外释放度符合Ritger-Peppas方程(r=0.9983),释放指数n=0.5454,符合0.45<n<0.89,该制剂体外释药机制为扩散和骨架溶蚀的协同作用。结论本钩吻素子亲水凝胶骨架缓释片具有良好的缓释效果。

钩吻生物碱的提取分离及结构鉴定

中草药钩吻中具有抗癌活性生物碱单体成分的提取分离,并测定其结构。方法:药材粉碎后用3%NaOH碱化后,晾干,用氯仿浸泡,回收氯仿提取液得浸膏。加酸溶解后,用氯仿萃取,碱化水层,再用氯仿萃取,得到钩吻总生物碱。然后经硅胶柱层析、反相ODS柱层析以及制备型HPLC层析分离纯化,并经理化性质和光谱学数据的测定鉴定单体化合物的结构。结果:共分离得到12个单体化合物,经测定紫外光谱、1H-NMR数据并与文献报道相比较,初步确定两个化合物的结构分别为gelsemine和koumine。结论:通过硅胶柱层析、ODS柱层析和HPLC相结合的方法可以达到分离钩吻总生物碱的目的。

市售钩吻药材质量研究

目的 通过对市售的钩吻药材进行质量鉴别和含量测定,了解市售钩吻的质量情况。方法 从性状鉴别、含水量、醇溶性浸出物含量和钩吻素子含量等方面进行质量分析。结果 市售钩吻药材多为茎的切片;各药材含水量相差不大,平均为11.0%;醇溶性浸出物含量2.24%~6.25%;钩吻素子的含量为0.01%~0.16%。结论 市售钩吻的药材质量参差不齐,应制定相应的钩吻药材质量标准以保证用药。

HPLC法同时测定钩吻茎中胡蔓藤碱丙等6个生物碱的含量

目的:建立HPLC法同时测定钩吻茎中胡蔓藤碱丙、钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己、钩吻绿碱和胡蔓藤碱乙的含量,并比较评价各产地钩吻生物碱含量的差异。方法:采用外标法进行测定,色谱柱为ZORBAX Bonus-RP Analytical(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为甲醇-0.1%甲酸水梯度洗脱,流速1.0 m L·min^(-1),检测波长254 nm,柱温30℃。分别测定32批钩吻茎,并进行聚类分析。结果:胡蔓藤碱丙、钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙6个成分的线性范围分别为1.00~50.06μg·mL^(-1)(r=1.000 0)、1.13~50.85μg·mL^(-1)(r=0.999 8)、1.16~52.20μg·mL^(-1)(r=1.000 0)、1.16~52.20μg·mL^(-1)(r=0.999 7)、1.06~50.88μg·mL^(-1)(r=0.999 7)和1.01~50.50μg·mL^(-1)(r=1.000 0),平均加样回收率为93.1%~103.8%(RSD为2.0%~2.9%)。不同产地样品中钩吻茎中胡蔓藤碱丙、钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己、钩吻绿碱和胡蔓藤碱乙含量范围分别为0.136~2.202、0.564~2.686、0.718~3.553、0.160~2.025、0.151~3.493、0.288~4.700 mg·g^(-1)。结果显示不同产地的钩吻6个成分含量均有差异,32批不同产地钩吻药材可聚为6大类。结论:该法可为钩吻多指标成分的质量评价提供参考。不同产地钩吻的各个化学成分的含量呈现明显分类特点,为钩吻地区鉴定提供依据。

固相萃取-气质联用结合同位素峰形校正检索技术分析钩吻中的钩吻碱和钩吻碱子

目的：建立固相萃取-气质联用并结合同位素峰形检索技术（SPE-GC／MS-CLIPS）分析钩吻中的钩吻碱和钩吻碱子的方法。方法：样品采用1％盐酸超声提取，经PCx固相萃取小柱净化，再用氨化甲醇进行洗脱，洗脱液浓缩后用丙酮定容。供试液通过气相色谱质谱联用仪结合毛细管柱（HP-5MS0．25mm×30m×0．25μm），用全扫描模式（rrdz40～500）采集数据后，利用同位素-C峰形检索技术对目标峰进行校正分析。结果：根据钧吻植物的生物碱提取物所得到的质谱谱图，通过与NIST标准库的匹配与同位素峰形检索技术推算的分子式，确定了钩吻中的钩吻碱和钩吻碱子。该方法成功应用于钩吻中毒司法鉴定案例2例，共10批样品。结论：固相萃取一气质联用结合同位素峰形校正检索技术可以准确分析钩吻中的钩吻碱和钩吻碱子，能应用于钩吻的植物鉴定和钩吻中毒司法鉴定工作。