广东分离株HPV16型L2与重组E7融合蛋白原核表达载体的构建

分析广东分离株HPV16型的L2和E7基因结构,并对E7的4个功能区重新排列组合形成失去致癌作用但其抗原表位不改变,其命名为rE7,构建pET-28a-L2、pET-28a-rE7、pET-28a-L2-rE7、pET-28a-rE7-L24个原核表达质粒.采用PCR技术从广东分离株HPV16基因组中扩增L2基因;用重叠PCR技术人工合成rE7基因和L2-rE7、rE7-L2融合基因,并构建到原核表达载体pET-28a(+)上.成功扩增广东分离株HPV16型L2基因,经重叠PCR技术成功得到rE7、L2-rE7和rE7-L2基因并成功构建了原核表达的4个载体:pET-28a-L2、pET-28a-rE7、pET-28a-L2-rE7、pET-28a-rE7-L2.广东分离株HPV16型L2基因与中国标准株有9处不同,同源性为99.37%,其编码氨基酸序列有8处突变.成功合成失去致癌作用的基因rE7及构建4个原核表达载体.

HPV11型L2E7融合蛋白的原核表达及其免疫效果观察

目的构建人乳头瘤病毒11型L2E7原核表达系统pET9aHPV11L2E7，并纯化蛋白进行小鼠免疫效果研究。方法从尖锐湿疣组织中扩增人乳头瘤病毒11型12、E7基因片段，构建DET9aHPV11L2E7原核表达重组质粒并测序，在大肠埃希菌宿主菌BL21（DE3＋）中经IPTG诱导表达融合蛋白L2E7（553个氨基酸），经SDS—PAGE电泳和Western Blot进行鉴定。CM离子交换介质纯化蛋白免疫BALB／c小鼠，进行细胞免疫水平和体液免疫水平的检测。结果成功构建了pET9 aHPV11L2E7原核表达系统，纯化获得的HPV11L2E7蛋白免疫BALB／c小鼠后能检测到针对HPV11E7特异性的细胞免疫，血清中能检测到高效价抗HPV11L2E7抗体。结论纯化的HPV11L2E7融合蛋白能够引发特异性细胞和体液免疫反应，能作为尖锐湿疣免疫治疗候选疫苗。

四种参考作物蒸散量综合法的比较

参考作物蒸散量(ET0)的估算是作物需水量计算的关键,诸多估算方法在不同地区具有不同的适应性。本文利用中国农业主产区6个代表站点的气象数据,以FAO 56 Penman-Monteith(PM)为标准,对常用的1963 Penman(Pen63)、FAO 1979 Penman(FAO 79)、FAO 24 Penman(FAO 24)及1996Kimberly Penman(Kpen)共4种参考作物蒸散量综合方法进行比较评价。结果表明:(1)Pen63、FAO 79及Kpen的日估算值均比PM估算值偏高,FAO 24偏低,其平均偏差分别为0.28、0.52、0和-0.17mm?d-1,相对偏差为16.0%、25.2%、2.4%、-5.3%,相对均方根误差为12.1%、22.4%、14.2%和13.5%。(2)Pen63、FAO79的月估算值显著高于PM值,在高估最大的5月份平均偏高12.5mm(10.8%)和28.2mm(22.6%)。FAO24表现为低估,低估最大的月份平均偏低11.4mm(8.1%),但在南方站点多数月份的估算值与PM估算值无显著差异。Kpen月估算值与PM估算值相比,既有高估(5-10月),也有低估,高估最大的月份平均偏高19.7mm(14.5%),且在南方站点的秋冬季有近6个月与PM无显著差异。(3)Pen63和FAO79的年值均显著大于PM年值,平均偏高103.8mm(11.8%)和191.5mm(21.3%)。FAO24年平均低估PM值60.9mm(6.3%),Kpen则平均高估50.5mm(5.8%)。(4)时间尺度对评价结果具有一定影响,4种综合法依据日、年值的评价效果排序分别为Pen63>FAO24>Kpen>FAO79和Kpen>FAO24>Pen63>FAO79。在日尺度下4种方法更适于湿润气候,但年尺度下仅FAO79和FAO24较适于湿润气候。可见,4种综合法以Pen63普适性最好,FAO79最低,因此使用FAO79前对其进行适应性评价尤为重要。

家榆种子老化过程中ROS-类caspse-3途径的初步研究

以家榆种子为试材,在37℃、100%相对湿度下进行老化处理后,结合DAPI染色和细胞原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法(TUNEL)、激光共聚焦技术以及生化分析,检测家榆种子人工诱导老化过程中细胞核、活性氧(ROS)和类半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性的变化.结果显示:随着老化程度加深,种子细胞染色质皱缩、凝聚,继而解体并被排出体外;表皮中最先发现TUNEL凋亡核,而后逐渐延伸到子叶和胚轴;老化处理5d时种子活性氧信号最强,且其与程序性死亡相关事件的发生具有时空一致性,同时在胞浆中检测到较强的caspase-3活性.研究表明,家榆种子人工老化可导致细胞程序性死亡,且存在与ROS迸发及类caspase-3相关联的信号通路.

2-(苯甲基)-7-氯茚并[1,2-e][1,3,4]噁二嗪-2,4a(3H,5H)-二羧酸4a甲酯的合成

以5-氯-1-茚酮为起始原料,经羰基化、不对称氧化、腙化和缩合反应合成了高效杀虫剂茚虫威的关键中间体2-(苯甲基)-7-氯茚并[1,2-e][1,3,4]噁二嗪-2,4a(3H,5H)-二羧酸4a甲酯。以5-氯-1-茚酮计,产品总收率达61.1%,产品结构经核磁共振分析验证。探讨了原料配比、溶剂的选择、氧化剂等因素对反应收率的影响。

HPV抗原表位及其在疫苗中的应用综述

人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)引起的宫颈癌在全球女性易患癌症中位列第4名,其相应疫苗的研发制备也成为研究的热点。HPV主要致病蛋白有L1、L2两个衣壳蛋白和E6、E7两个致癌蛋白。L1作为主要抗原,其表位分为线性表位、构象表位和B/T细胞表位。其中线性表位的一部分(HPV16-L1蛋白的RHGEEYDLQFIFQLCKITLTA、HPV 18-L1蛋白的PVPGQYDATK等表位)、构象表位的一部分(H16U4、H16V5等)和HPV16-L1部分片段(H2、H3、H4、H9、H11、H12)中的B细胞、T细胞表位都有潜力成为研制以L1为主要抗原疫苗的靶标。近些年来,由于L2蛋白对不同类型HPV的交叉中和保护作用,许多研究的重点开始向L2蛋白转变,尤其是针对L2 N末端处表位加以不同的载体和佐剂赋予L2疫苗不同的特性,L2疫苗比L1疫苗的保护范围更加广泛。E6、E7特异性表位肽和CpG疫苗也是研究HPV治疗性疫苗的新方向。本文将对HPV疫苗及其相关表位的最新进展进行综述。

探讨血清中α_l-微球蛋白、同型半胱氨酸和胱抑素C在2型糖尿病肾病患者检测中的意义

目的探讨对2型糖尿病肾病患者实施相关临床指标进行检测的效果与临床意义。方法方便收集50例2型糖尿病肾病患者的临床资料予以回顾性分析研究,资料收集时间为2015年1月—2016年12月。将这50例患者设为实验组,另从同期在该院接受体检的人群中随机选择50名设为健康对照组。于清晨空腹状态下采集两组研究对象的静脉血,检测同型半胱氨酸以及胱抑素C水平。另收集两组的中段晨尿送检,采用免疫散射比浊法检测α_1-微球蛋白水平。结果两组研究对象在平均年龄以及平均体质量等方面情况基本相同,各项临床指标经比较差异无统计学意义(P>0.05)。对两组研究对象的α_1-微球蛋白、同型半胱氨酸和胱抑素C水平进行检测,记录检测结果并进行组间统计学比较可得,实验组检测水平分别为(19.85±5.02)mg/L、(15.78±3.12)μmol/L、(1.51±0.45)mg/L,均显著高于对照组的(3.75±1.27)mg/L、(9.12±2.35)μmol/L、(0.62±0.21)mg/L(P<0.05)。结论对2型糖尿病肾病患者的血清中α_1-微球蛋白、同型半胱氨酸和胱抑素C指标进行检测可较为直观的了解到患者的肾脏功能损伤情况,为临床诊治提供一定的参考依据。

人乳头瘤病毒16型疫苗的研究

人乳头瘤病毒16型（HPV16）感染人类上皮，可引起恶性肿瘤，对于其疫苗的研究相应的有：壳蛋白（L1，L2）的疫苗，诱导机体产生中和抗体，主要用于预防HPV的感染；另一类是E6E7的表位或突变体制备的疫苗，用于HPV16相关肿瘤的治疗．

藏药甘青乌头化学成分研究

目的对甘青乌头Aconitum tanguticum抗炎活性部位中的化学成分进行研究,以阐明其清热解毒的药效物质基础。方法采用脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7的炎症模型,以NO释放量为评价指标考察甘青乌头各部位的抗炎活性,确定活性部位,然后采用多种现代色谱技术对活性部位的化学成分进行分离纯化,经过光谱技术以及与文献值比对的方法鉴定化合物结构。结果甘青乌头乙醇提取物上大孔吸附树脂后的30%乙醇洗脱部位抗炎活性最好,从该部位中共分离鉴定了13个化合物,分别是香草酸(1)、七聚己内酰胺(2)、榜嘎苷D(3)、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→2)-[β-D-葡萄糖基-(1→3)-α-L-(4-O-反式-对香豆酰基鼠李糖基)-(1→6)]-β-D-甘露糖基-7-O-α-L-鼠李糖苷(4)、山柰酚-3-O-[α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-甘露糖基-7-O-α-L-鼠李糖苷(5)、4-二羟基苯乙氧基-8-O-β-D-[6-O-(4-O-β-D-吡喃葡萄糖基)-阿魏酰基]-吡喃葡萄糖苷(6)、榜嘎苷C(7)、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-[α-L-鼠李糖基-(1→6)]-β-D-甘露糖基-7-O-α-L-鼠李糖苷(8)、槲皮素3-O-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-甘露糖基-7-O-α-L-鼠李糖苷(9)、榜嘎苷A(10)、2-甲氧基-4-羧基-苯基-O-β-D-[6-O-(4-O-β-D-吡喃葡萄糖基)-阿魏酰基]-吡喃葡萄糖苷(11)、槲皮素-3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖基]-7-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖苷(12)、槲皮素-3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-(4-O-反式-咖啡酰基)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖基]-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(13)。结论化合物11~13为新化合物,分别命名为榜嘎酸A、榜嘎苷E、榜嘎苷F;化合物8为首次从甘青乌头中分离得到,研究结果不仅部分阐明了甘青乌头清热解毒的药效物质基础,而且丰富了天然产物的结构类型。

基于多元功效成分的瓜蒌皮药材产地现代干燥加工方法研究

目的比较不同干燥方式对瓜蒌皮药材品质的影响,优选出适宜的瓜蒌皮药材产地现代干燥加工方法。方法收集安徽产新鲜瓜蒌皮,分别采用传统与现代产地加工干燥方法[40、50、60、70℃控温热风干燥,40、50、60、70℃微波真空干燥(真空度-0.08 MPa),50、60、70℃中短波红外干燥,-80℃真空冻干干燥,晒干,阴干]加工处理,结合干燥样品外观性状,以药效成分(5种黄酮类芦丁、木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、芹菜素、橘红素,3种三萜类葫芦素D、葫芦素B、葫芦素E)、营养滋补类成分(2种糖类葡萄糖、果糖,18种氨基酸类苯丙氨酸、L-亮氨酸、异亮氨酸、L-色氨酸、γ-氨基丁酸、L-蛋氨酸、L-缬氨酸、脯氨酸、L-酪氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-丝氨酸、L-天门冬酰胺、L-瓜氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸,12种核苷类胸腺嘧啶核苷、2′-脱氧尿苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷、2′-脱氧肌苷、肌苷、胞嘧啶、鸟嘌呤、2′-脱氧鸟苷、胞苷、鸟苷)共40种资源性化学成分的组成及含量为评价指标,对不同干燥加工方法所得瓜蒌皮药材样品的品质进行综合评价。利用主成分分析(PCA)法,优选瓜蒌皮最佳现代干燥加工方法。结果不同干燥品中,药效成分及营养滋补类成分含量差异较大,其中果糖及葡萄糖质量分数分别为9.78%~21.32%、4.46%~15.63%;70℃微波真空干燥处理获得的瓜蒌皮所含黄酮类和四环三萜类成分总量最高,40℃控温热风干燥处理的总量最低。通过对14种不同干燥方式获得的瓜蒌皮样品进行综合评价分析,发现70℃控温热风干燥、70℃中短波红外干燥、-80℃真空冻干干燥、50℃微波真空干燥和60℃控温热风干燥方式获得的样品有效成分含量均优于传统晒干。结论结合药材的外观性状、色泽、质地、干燥时间及功效成分含量等因素,基于目前企业设备现状,建议70℃控温热风干燥为瓜蒌皮产地加工条件;基于未来新型设备的发展,70℃中短波红外干燥可作为瓜蒌皮产地加工的发展方向。研究结果将为瓜蒌皮药材产地加工的规范化和品质特征的形成提供借鉴。