利用分子标记辅助选择聚合水稻基因Xa21和Pi9(t)

通过有性杂交和田间多代选育,利用分子标记辅助选择和田间/温室抗性鉴定,将广谱高抗白叶枯病的Xa21基因和高抗稻瘟病的Pi9(t)基因聚合到同一品系中,获得双基因纯合且农艺性状稳定的株系。用中国7个和安徽省流行白叶枯病病菌以及多个稻瘟病小种进行抗病性鉴定,结果表明:双抗基因系同时抗白叶枯病和稻瘟病,抗性级别为HR-R,抗谱与供体亲本一致,抗性水平基本相当。室内考种结果显示:双抗基因系间株高变异较大;单株有效穗比两亲本弱;结实率和千粒重明显优于Xa21基因的供体M12,与Pi9(t)基因的供体亲本75-1-127相当。

水稻抗白叶枯病基因Xa21转基因水稻及其杂交稻研究

用基因枪转基因技术将高抗白叶枯病的Ｘａ２１基因导入中国三系杂交稻恢复系（明恢６３）和保 持系（皖Ｂ）中，获得转基因水稻系，其中４个株系只含有Ｘａ２１基因，不合选择标记潮霉素抗性基因 ｈｐｈ。筛选抗白叶枯病转基因纯合系，在田间种植６代，用ＰＣＲ检测证明，Ｘａ２１基因能稳定遗传表达。 用转基因水稻配制两系杂交稻，杂交组合Ｆ１含有Ｘａ２１基因，既抗白叶枯病，又有较大的增产潜力。

水稻白叶枯病抗性基因Xa21的分子生物学研究进展

由黄单胞杆菌水稻致病变种Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)引起的白叶枯病是水稻重要细菌性病害之一。迄今,已有7个水稻白叶枯病抗性基因被克隆。Xa21是第一个被克隆的白叶枯病抗性基因,因具有广谱抗性而受到广泛的关注。对Xa21的发现、定位及克隆、表达特征、编码产物XA21的生化特性、作用与调控以及XA21介导的免疫反应模式等方面的研究结果进行综述,并对今后的研究方向进行展望。

利用Bt基因和Xa21基因转化获得抗螟虫、白叶枯病的转基因水稻

利用水稻的愈伤组织作受体 ,采用 PIG基因枪法 ,首先成功地将 Bt基因 [cry IA(b) ]连同抗除草剂 bar基因导入栽培水稻品种中国 91,选育出纯合稳定的株系 T91系。然后将 T91系与黄淮区主栽品种豫粳 6号杂交 ,并辅以标记基因选择 ,选育出纯合稳定、综合性状优良的转 Bt基因株系 C48。利用农杆菌介导的转化系统将 X a2 1基因转入 C48,根据标记基因测定 ,转基因植株的 PCR和 Southern分析 ,田间抗病虫性鉴定 ,获得了双抗 (螟虫、白叶枯病 )

Xa21基因导入水稻及转基因植株的鉴定

以水稻愈伤组织为受体、质粒 pCXK130 1为Xa2 1基因供体 ,用农杆菌EHA10 5和PDS - 10 0 0 /He基因枪转化受体 ,经Hyg浓度梯度筛选 ,获得一些转基因水稻植株 .GUS检测、PCR扩增和Southern杂交分析表明 ,报告基因(GUS)、选择标记基因 (Hygr)和抗白叶枯病基因Xa2 1都已整合入转化水稻基因组中 ,Southern杂分析显示了Xa2 1基因在转化水稻基因组中整合的拷贝数 .田间接菌鉴定表现抗白叶枯病 .图 4参

水稻白叶枯病广谱抗性基因Xa21导入两用不育系培矮64S

以克隆的Xa21基因为外源基因,成熟胚愈伤组织为转化受体,应用农杆菌介导法对水稻两用型核不育系培矮64S进行转化,获46株转基因植株。PCR和Southern分析结果表明,Xa21已整合到受体基因组。用稻白叶枯病病原菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)菲律宾小种6号接种鉴定,结果表明大多数转基因植株获得了抗病性。已整合的Xa21基因能够稳定地遗传,在所检测转基因株系的T1代中,Xa21基因显示3:1的分离。

云南野生稻中Xa21基因外显子Ⅱ的分离及序列分析

Xa21是已经分离克隆的一个具有广谱抗性的水稻白叶枯病抗性基因,根据已克隆的白叶枯病抗性基因Xa21外显子Ⅱ序列设计特异性引物对云南3种野生稻及其他稻种进行PCR扩增。结果表明,只有普通野生稻(景洪普通野生稻和元江普通野生稻)及长雄野生稻中扩增到了长400bp的目的片段,而疣粒野生稻和药用野生稻及栽培稻中均没有扩增到目的片段。通过序列比较发现所克隆的序列同长雄野生稻的氨基酸序列变化是随机的。

农杆菌介导籼稻Xa21基因的转化及其遗传研究

应用农杆菌介导转化体系 ,成功地将Xa2 1基因导入籼稻幼胚来源的愈伤组织 ,获得籼稻优良恢复系T461、优良常规品种粤香占和中 1 0 63个品种共 3 3个独立的转基因株系。PCR和Southern分析结果表明 ,Xa2 1基因已整合到转基因植株基因组中。接种分析表明 ,T0 代转基因植株的白叶枯病抗性得到不同程度的提高 ,转基因植株自交T1代白叶枯病抗性表现出分离 ,且大多为 1～ 2个整合位点的孟德尔方式遗传 ,与Southern分析结果一致。

云南野生稻抗白叶枯病类Xa21基因的鉴定

水稻白叶枯病是水稻生产上的主要细菌病害之一。从野生稻中发掘优异的水稻白叶枯病抗性材料,可以拓宽栽培稻抗白叶枯病遗传基础。经过温室接菌鉴定和PCR标记分析,对云南野生稻进行Xa21基因的检测鉴定。温室接菌鉴定表明,云南野生稻对广谱致病小种PX099及云南强致病菌Y8具有较好的抗性能力,特别是疣粒野生稻对致病菌株达到免疫程度;PCR标记分析表明,云南野生稻不含有Xa21基因,但含有与Xa21基因某些区域同源的片段。本研究结果为寻找新的抗源材料及快速发掘利用云南野生稻中的抗白叶枯病基因提供理论依据。

水稻抗病基因Xa21转入3个粳稻品种的抗性初步分析

通过农杆菌介导转化,将已克隆的水稻白叶枯病抗性基因Xa21转入我国辽宁省3个粳稻品种:沈农606、辽粳454、辽粳294,共获得独立转基因系205个。通过PCR、GUS染色和Southernblot分析,证明Xa21基因已经整合到3个粳稻栽培品种的基因组中。通过温室接种菲律宾白叶枯病小种6的代表菌系PXO99,T0代转基因水稻除了3-34表现部分抗性外,其它的转基因材料均表现高度抗病,表明Xa21转基因水稻已经获得抗性;温室接种T1和T2代试验表明,单拷贝整合的转化体呈现3∶1分离,同时单拷贝3-34材料也表现部分抗性和感病3∶1分离,证明已整合的Xa21基因能稳定遗传;同时对3-34部分抗性机制进行了分子生物学检测,证明GUS基因全部丢失、Xa21基因部分丢失并导致部分抗性。获得部分抗性材料,对于深入研究Xa21基因的功能区和研究抗病分子机制具有重要的意义。

一种简便高效的PCR辅助选择技术在杂交水稻转Xa21基因育种中的应用

介绍了一种在杂交水稻转Xa2 1基因育种中使用的PCR分子标记辅助选择技术。该技术结合测交和半粒种子法可以快速准确地筛选出转Xa2 1基因纯合株系和转Xa2 1基因杂交稻 ,大大提高育种效率 。

转Xa21基因培矮64SR2代性状的表现

观察了培矮 6 4 S转 Xa2 1基因 R2代植株的抗病性及其农艺性状 ,结果表明 ,多数转 Xa2 1基因植株抗病力显著高于对照 ,抗病植株均能检测到 Xa2 1特异扩增带 ,它能稳定遗传并表达 ,标记基因GUS只在种子愈伤组织中表达 ,而在叶片中不表达 ,它和 Xa2 1基因呈连锁 .不同转基因株系间农艺性状变异显著 ,与对照培矮 6 4 S也有明显差异 .

水稻Xa21基因启动子序列分析及其在不同条件下的表达特征

以水稻品种‘日本晴’(Oryza sativa‘Nipponbare’)为实验材料,根据GenBank上公布的同品种水稻的基因组DNA序列设计1对引物,对水稻Xa21基因启动子进行克隆并测序,通过PCR扩增获得的Xa21基因启动子序列长1 982 bp,其中除包含启动子基本元件外,还包含一些与逆境信号相关的元件(GCC-box、A-box、TC-rich repeats、MBS、LTR和W-box等)。利用GUS组织化学染色和定量分析方法,研究了转基因水稻T1代株系不同器官和发育阶段Xa21基因启动子的表达特异性及其在不同逆境和激素处理条件下的表达特征,结果显示:在转基因水稻的叶、茎和根部均能检测到GUS活性,但根部GUS活性最高,特别是在根尖的中柱区活性最强;随苗龄增长(3叶期、5叶期和8至9叶期)叶片中GUS活性逐渐增加,8至9叶期GUS活性最高;机械损伤和100μmol.L-1茉莉酸甲酯(MeJA)处理可使叶片中GUS活性显著或极显著提高,而干旱、500μmol.L-1水杨酸(SA)和100μmol.L-1脱落酸(ABA)处理则对叶片中GUS活性无明显影响。研究结果表明:外界逆境胁迫对水稻Xa21基因启动子的表达有诱导作用;该启动子的表达受水稻发育阶段的调控并具有一定的器官组织特异性,在根中的表达量最高;其介导的抗病反应依赖于茉莉酸(JA)信号通路。

水稻转录因子WRKY68在Xa21介导的抗白叶枯病反应中发挥正调控作用

白叶枯病是一种严重影响水稻产量的细菌性病害。Xa21是第一个克隆的抗白叶枯病基因,具有广谱抗性,在水稻抗病育种中被广泛应用。转录因子的鉴定对解析Xa21介导的水稻抗白叶枯病分子机制具有重要意义。本研究构建了Xa21背景下的WRKY68-RNAi转基因水稻。与受体材料4021相比,转基因水稻中WRKY68蛋白质丰度下调,接种白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)后抗病性下降,证明WRKY68基因在Xa21介导的抗白叶枯病反应中发挥正调控作用。此外,转基因受体材料4021和感病对照TP309接种后不同时期和部位叶片中WRKY68的蛋白质丰度没有显著差异,表明WRKY68蛋白质的表达不受抗病基因Xa21和病原物Xoo诱导,推测其功能主要是调控下游基因的表达。WRKY68-RNAi转基因水稻接种后,PR1A、PR5、PR10A、PR-pha和PAL1等病程相关蛋白质表达丰度发生变化,表明相关基因可能在WRKY68基因的调控下参与下游抗病反应。

Xa21全生育期表达载体的构建

利用PCR技术,以水稻品种明恢63基因组DNA与携Xa21完整基因组片段的载体pDBXa21作为模板,分别克隆了RSuS1启动子(RSP)、Xa21的开放阅读框至终止子的片段,并构建了RSP驱动水稻广谱抗白叶枯病基因Xa21的转基因表达载体。实时荧光定量PCR技术证实,水稻蔗糖合酶基因1(rice sucrose synthase gene 1,RSuS1)在水稻种子中低表达,在叶鞘与叶中全生育期高效表达。

转Xa21基因圣稻301的培育及其田间表现

利用农杆菌介导的遗传转化系统 ,将白叶枯病抗性基因Xa2 1导入山东主栽品种圣稻 30 1胚性愈伤组织 ,从T0 至T5代 ,利用GUS染色和分子标记辅助逐代选择并进行田间抗病虫性鉴定 ,获得了大量纯合稳定的转基因圣稻 30 1。

分子标记辅助培育水稻抗白叶枯病和稻瘟病三基因聚合系

水稻的白叶枯病和稻瘟病是水稻的两大主要病害，通过分子标记辅助选择与传统的杂交、自交相结合的方法，将抗稻瘟病的Pi9（t）基因和抗白叶枯病的Xa21及Xa23基因聚合到同一株系中，经多代大田或／和温室接菌鉴定、室内标记选择和田间农艺性状的筛选，获得了4个三基因聚合且农艺性状优良的株系L17-L20。用不同国家和地区的20个稻瘟病小种、中国流行的7个白叶枯病菌系c1-c7以及安徽省流行的白叶枯病菌系进行大田或，和温室抗病性鉴定，结果显示，株系L17-L20对20个稻瘟病小种均表现出抗性，抗性水平与Pi9（t）基因的供体亲本75-1-127相当，抗谱相同；对白叶枯病的抗性和抗谱与Xa23基因相似，不论在苗期还是在成株期均抗白叶枯病。与Xa21、Xa23基因的供体亲本M12和CBB23相比，成株期的抗性水平有所增强。利用多重PCR技术，在同一PCR反应中可同时选择Pig（t）和Xa21基因，提高了PCR选择效率。

利用分子标记改良水稻白叶枯病抗性的研究

利用分子标记技术对转抗白叶枯病基因 (Xa2 1)的明恢 63和 80 4B后代进行跟踪筛选 ,得到了纯合稳定株系。同时对转基因恢复系明恢 63进行配组试验 ,对转基因 80 4B纯合稳定系进行不育系的转育 ,并对其配组和转育后代进行PCR分析和人工接菌 ,结果表明Xa2 1基因能稳定遗传表达 。

云南药用野生稻BIBAC文库混合克隆池制备及筛选

在已构建完成的云南药用野生稻BIBAC(binary bacterial artificial chomosome)文库的基础上,将文库制备成一、二、三级混合克隆池,各级混合池的数量分别为3 360、140和14个。根据Xa21抗病基因序列设计1对特异引物,利用4步PCR法对文库混合克隆池进行逐级筛选,初步确定了3个抗病基因阳性克隆。为今后以PCR法高效利用云南药用野生稻BIBAC文库挖掘其优异基因奠定了良好的基础。

白叶枯病抗病基因Xa21与Xa23的聚合育种研究

由黄单胞细菌引起的水稻白叶枯病是水稻的三大病害之一,而广谱持久抗病品种的培育是控制该病害最经济有效的措施。本研究利用Xa21的优化功能标记与苗期白叶枯病抗病鉴定,将目前抗谱最广、抗性最强的两个位于同一染色体上的显性基因Xa21与Xa23聚合到杂交稻重要恢复系明恢86,从2138株F2分离后代里,最终得到9株Xa21及Xa23基因的聚合植株。本研究可为紧密连锁的基因聚合提供了新的思路。