小麦基因克隆研究进展

小麦的基因克隆研究主要集中在品质、抗病、抗逆性、光合、春化等几个方面。在品质方面,已克隆了编码小麦高、低分子量谷蛋白亚基的基因、小麦淀粉合成酶基因及编码黑麦碱的基因;在抗病、抗逆性方面,已克隆了6个与白粉病有关的cDNA、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因、抗小麦根节线虫基因、盐胁迫应答基因、水分胁迫诱导基因、与重金属解毒有关的基因;另外,还克隆了小麦叶绿体基因组中与光合作用有关的psbA基因和与春化有关的基因Vrc79、Vrc54、Vrc203、Vrc17、Vrc28等。在小麦中还克隆到一个GTP结合蛋白的cDNA克隆、EIF转录因子的cDNA克隆及异构酶基因家族FKBP73基因的启动子序列。

生长抑素基因在大肠杆菌pThioHis表达系统中的克隆与表达

目的 在大肠杆菌表达系统中高效表达生长抑素 (SS)基因。方法 以天然SS的氨基酸和基因序列为标准 ,将大肠杆菌使用频率较低的密码子分别更换成了使用频率较高的密码子 ,在SS基因的两端加上了合适的酶切位点 ,头部 :KpnI和NcoI;尾部 :PstI(这一酶切位点可与NsiI的切口互补 )。克隆至pThioHisA质粒的KpnI/PstI酶切位点后 ,再克隆至pThioHisA质粒的KpnI/NsiI酶切位点 ,使SS基因分别位于多克隆位点的尾部和前部。结果 重组质粒经酶切鉴定和基因序列测定证明 ,基因完全正确 ,在大肠杆菌TOP10中均得到较好的表达 ,IPTG诱导后 4h表达量基本达到最高 (37℃ ) ;在A60 0 0 .4～ 1.5之间用IPTG诱导均可获得到较好的表达 ,但以 0 .6左右为最佳诱导时机 ;在LB、TB和 2YT培养基中表达量依次为 :TB >LB >2YT ;表达的SS融合蛋白基本为水溶性的 ,具有良好的SS抗原性和免疫原性。

茶树甜菜碱醛脱氢酶基因(CsBADH1)的全长cDNA克隆与表达分析

甜菜碱是一种能在逆境下大量积累的无毒性渗透相溶物质,而甜菜碱醛脱氢酶(BADH)是甜菜碱合成途径中的关键酶之一。本实验采用SMART-RACE技术获得了茶树甜菜碱醛脱氢酶基因的全长cDNA序列,命名为CsBADH1(GenBank登陆号:JX050145),并对其进行相关的生物信息学分析。结果表明:CsBADH1的cDNA序列全长1 972 bp,其开放阅读框(ORF)为1 518 bp,编码505个氨基酸,预测分子量为54.8 kD,理论等电点(PI)为5.652,是疏水性很强的蛋白,且具有BADH基因典型的高度保守十肽基序(VTLELGGKSP)和与醛脱氢酶(ALDHs)功能有关的半胱氨酸残基(C)。系统进化树分析表明,茶树BADH氨基酸序列与人参(Panax ginseng)的亲缘关系最近,相似度达87%,其余相似性也大部分在80%以上。实时荧光定量PCR分析结果显示:该基因在经历一定时间的冷驯化后表达量升高,说明CsBADH1基因可能参与茶树的冷驯化作用。

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因4的克隆化研究

目的 丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 5A(NS5A)病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因NS5ATP4的基因序列的确立及基因克隆化研究。方法 依据我室构建的NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,利用生物信息学技术获得新基因NS5ATP4的编码序列 ,对其可能的氨基酸序列进行分析比较 ,并对其基因利用多聚酶链反应技术 (PCR)进行克隆化研究。结果 发现了HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因NS5ATP4。结论 这一发现 ,为阐明HCVVNS5A蛋白的反式激活作用及其机制 。

茶树GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因cDNA全长的克隆与表达分析

抗坏血酸(Vc)是重要的抗氧化剂,在茶树体内的各种生理代谢及抵御非生物胁迫中起重要作用,Vc含量关系到绿茶品质优劣。GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶(GMP)是茶树Vc生物合成途径中的关键酶之一。本研究通过RACE-PCR方法从茶树中克隆了GMP c DNA全长序列,共计1510 bp,其中包含1 086 bp的开放阅读框(ORF),编码361个氨基酸,推测蛋白分子量为39.599 k Da。BLAST分析表明,茶树GMP基因氨基酸序列与猕猴桃的亲缘性最高,达到96%。实时定量PCR分析表明,茶树新梢芽下第三叶中GMP基因表达量最高,嫩茎中最低,不同品种茶树新梢叶片中表达量存在明显差异。高温胁迫初期,GMP基因表达量及抗坏血酸含量迅速升高,然后逐渐下降且均低于同期对照。

蒙古马肌生成抑制基因(MSTN)的克隆及序列分析

肌生成抑制基因(MSTN)在发育和成熟的骨骼肌中特异表达,并对肌肉发育和再生具有负调控作用。依据马肌生成抑制素(MSTN)编码序列设计引物,以蒙古马基因组DNA为模板,利用PCR技术,扩增出MSTN基因的几个片段后,测序并按顺序拼接,得到DNA全序列。序列分析结果表明,MSTN基因由2个内含子和3个外显子组成,碱基数量分别为第一外显子373 bp、第二外显子374 bp、第三外显子381 bp;第一内含子1 833 bp、第二内含子2 018 bp,共有4 979个碱基。该序列首次登录到GenBank,登录号为AY840554。

犬瘟热病毒疫苗株H蛋白基因片段的克隆与表达及表达产物抗原性的初步鉴定

根据发表的犬瘟热病毒(CDV)参考株Ondetstepoort的序列设计一对引物,以CDV感染的Vero细胞总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到549bp DNA片段,将该片段以正确的阅读框架定向克隆于pGEX-4T-1中,然后将重组质粒转化宿主菌RosettaTM,在37℃、1.0mmol/L IPTG诱导下外源基因获得良好表达。经SDS-PAGE鉴定,表达的融合蛋白约46ku,与预期值一致。Western blot试验显示,CDV免疫的小鼠血清可特异的识别该重组蛋白,表明该重组蛋白具有一定的免疫原性。

罗非鱼无乳链球菌EsxA基因克隆与原核表达

Ⅶ型分泌系统(T7SS)是近年来发现的分泌系统,分泌两种胞外蛋白,EsxA基因编码的ESAT6蛋白和EsxB基因编码的CFP-10蛋白。分泌蛋白具有良好的免疫原性,促进细菌从巨噬细胞吞噬体逃逸、影响巨噬细胞凋亡及裂解细胞等生物学功能,与致病性密切相关。以罗非鱼源无乳链球菌为模板,克隆到294bp的EsxA基因,将目的序列克隆到pMD18-T载体,经测序,目的序列与无乳链球菌EsxA基因同源率在99%以上。EsxA基因克隆到pET32a载体中,重组载体在28℃、0.5mmol/L IPTG诱导条件下表达量最大,可溶性表达。将纯化的ESAT6蛋白免疫Balb/c鼠,成功制备ESAT6蛋白鼠多克隆抗体,经Western blot,ESAT6蛋白具有良好的反应原性。研究结果为进一步进行无乳链球菌ESAT6蛋白的免疫学功能研究奠定了基础。

鸭瘟病毒GD株TK、dUTPase和PK基因的克隆及序列分析

根据已发表的鸭瘟病毒(DPV)TK、dUTPase、PK基因序列,设计合成了3对特异性引物,对DPV GD株的3个基因进行PCR扩增,产物克隆至PTA2载体并进行测序。结果表明,TK基因ORF全长为1 077 bp,编码358个氨基酸;dUTPase基因ORF全长为1 344 bp,编码447个氨基酸;PK基因ORF全长为1 158 bp,编码385个氨基酸。与GenBank上其他DPV毒株的同源基因进行比较,TK基因核苷酸的同源性为99.5%～100%,氨基酸同源性为98.9%～100%;dUTPase基因核苷酸的同源性为99.9%,氨基酸同源性为99.8%;PK基因核苷酸的同源性为99.8%～100%,氨基酸同源性为99.7%～100%。这表明TK、dUTPase、PK基因在DPV基因组中高度保守,为构建DPV基因缺失转移载体奠定了基础。

蚯蚓纤溶酶基因P_(239)的原核表达、纯化及活性测定

通过RT PCR方法从蚯蚓 (Lumbricusbimastus)中获得蚯蚓纤溶酶基因 ,命名为P2 3 9,含有 85 2个核苷酸 ,成熟肽编码 2 3 9个氨基酸 ,通过Genbank序列同源性比较 ,与已知的蚯蚓纤溶酶有一定的同源性 ,为首次获得的新基因。随后构建了 pBV2 2 0 /P2 3 9重组质粒 ,在大肠杆菌DH5α中进行原核表达 ,再经亲和层析柱纯化复性 ,其产物经活性测定 ,确定不仅具有激酶作用 ,而且具有直接溶栓活性。

根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区VirD1基因的克隆及序列分析

根据U.Washington报导的根癌土壤农杆菌(Agribacterium tumefaciens)C58Ti质粒基因序列,设计1对引物,利用PCR的方法扩增了c58根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区VirD1基因。通过琼脂糖凝胶电泳,所得目的片段略小于500bp,与引物设计跨幅片段476bp相吻合。将此片段连接到T载体,经蓝白斑筛选、PCR鉴定、测序及DNA序列分析,结果表明:克隆VirD1基因编码序列与报导的序列同源性达100％,说明通过PCR方法获得的VirD1基因片段是正确的,为进一步研究该基因的表达和活性奠定了基础。

鸽源H5N1亚型禽流感病毒株的全基因克隆及序列分析

根据已知禽流感病毒(AIV)的8个基因序列设计合成11对特异引物,通过反转录-聚合酶链式反应技术,分别成功扩增出鸽源H5N1亚型的全基因序列,将其分别克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。同时将8个基因片段与GenBank发表的相应序列进行比较,绘制各基因的进化树。结果表明所克隆到的8个片段均包含相应病毒基因的完整开放阅读框架,长度分别为1 7301、3711、5422、3222、3302、2331、020、884 bp核苷酸,分别编码568、450、499、757、759、716、351、230个氨基酸。该毒株有7个潜在糖基化位点;在HA裂解位点附近有6个碱性氨基酸序列插入,符合高致病力禽流感病毒的特点。该毒株与参考毒株的序列比较分析结果表明分离株基因具有多样性。

郑丰5号α-醇溶蛋白基因的克隆与序列分析

α-醇溶蛋白是小麦籽粒贮藏蛋白的重要组分,其组成与含量对小麦加工品质具有重要影响。利用PCR从郑丰5号基因组中克隆α-醇溶蛋白基因,并对其序列进行分析。经克隆共获得32个α-醇溶蛋白新基因(ZF5A-1～ZF5A-32,GenBank注册序列号为JX828280～JX828311),其中15个为假基因,17个(ZF5A-1～ZF5A-17)具有完整开放阅读框。17个α-醇溶蛋白新基因中,除ZF5A-1、ZF5A-3、ZF5A-6、ZF5A-9、ZF5A-10、ZF5A-11、ZF5A-15编码的蛋白在特征Ⅱ区含有1个额外的半胱氨酸(C)外,其他10个基因编码的蛋白均具有α-醇溶蛋白的典型结构。根据推断氨基酸序列中4种主要T细胞优势多肽的分布及多聚谷氨酰胺区的长度,推测ZF5A-7和ZF5A-12可能定位于6A染色体,ZF5A-4、ZF5A-13、ZF5A-14和ZF5A-17可能定位于6B染色体,而ZF5A-1～ZF5A-3、ZF5A-5、ZF5A-6、ZF5A-8～ZF5A-11、ZF5A-15和ZF5A-16可能定位于6D染色体。17个新克隆α-醇溶蛋白基因及4个已知α-醇溶蛋白基因编码的蛋白的二级结构预测结果表明:α-螺旋、β-折叠的位置和核心序列是相对保守的,但不同蛋白α-螺旋和β-折叠的数量以及参与形成同一保守区域α-螺旋和β-折叠的氨基酸残基数却并不相同。克隆的17个α-醇溶蛋白基因中,除ZF5A-17编码的蛋白缺少α-螺旋(H2)、ZF5A-2、ZF5A-8编码的蛋白在特征区Ⅰ均存在1个额外的α-螺旋(HE1)、GQ891685和ZF5A-15编码的蛋白在多聚谷氨酰胺Ⅱ区存在1个额外的α-螺旋(HE2)外,5个保守的α-螺旋(H1～H5)恒定出现在其他基因的2个谷氨酰胺重复区和特征区中;此外,在C-末端特征区大部分基因(61.11%)还形成1个β-折叠结构(E)。郑丰5号中具有较多额外半胱氨酸、α-螺旋和β-折叠的α-醇溶蛋白基因,可能与其良好的加工品质密切相关。

小鼠载脂蛋白CⅡ编码基因的克隆

目的:克隆小鼠载脂蛋白CⅡ(ApoCⅡ)编码序列。方法:采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法扩增获得ApoCⅡ编码序列,将ApoCⅡ基因编码片段重组入质粒pUC18,得到重组克隆载体pUC18-ApoCⅡ,进行序列测定。结果:经测序证实重组质粒pUC18-ApoCⅡ中的ApoCⅡ编码片段的序列与GenBank中的一致。结论:成功构建了含编码小鼠ApoCⅡ基因的重组克隆载体pUC18-ApoCⅡ,为基因工程生产有生物活性的ApoCⅡ、开展ApoCⅡ的免疫学测定及进一步探讨ApoCⅡ治疗高甘油三酯血症的可能性奠定了基础。

天蓝淡红链霉菌SIPI1482菌株graORF1同源基因的克隆

将含有ａｃｔⅢ基因的质粒ｐＩＪ２３４６及其带有ｇｒａＯＲＦ１～４质粒ｐＩＪ５２０５～５２０８作探针与天蓝淡红链霉菌ＳＩＰＩ１４８２菌种的染色体ＤＮＡ杂交。ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ显示ｐＩＪ２３４６能与２．１ｋｂ的ＢａｍＨⅠ片段杂交；ｇｒａＯＲＦ１能与约６．０ｋｂ和约１０ｋｂＢａｍＨⅠ以及约２０ｋｂＢｃｌⅠ片段杂交。除２．１ｋｂＢａｍＨⅠ片段外，其余的同源片段克隆到质粒ｐＵＣ１８形成几个克隆子，并经ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ确认这些同源片段的存在。含有约１０ｋｂ同源ＤＮＡ片段的ｐＹＧ２５，当转化加利利链霉茵３１６１７时，发现能大大地促进该菌株色素的分泌，表明约１０ｋｂＢａｍＨⅠ同源片段含有某种调节基因。当将质粒ｐＹＧ１１的约６ｋｂＢａｍＨⅠ同源片段克隆到ｐＩＪ６８０构成杂合质粒ｐＹＧ２６并导入变青链霉菌ＴＫ６４，发现同源基因的导入能引起变青链霉菌ＴＫ６４表型的显著变化，表明约６ｋｂ同源基因编码了某些与分化有关的基因。

龙眼胚性愈伤组织AGO6基因克隆及其在体胚发生过程中的表达分析

依据龙眼胚性愈伤组织转录组数据库Unigene序列,利用RT-PCR结合RACE技术,以龙眼胚性愈伤组织c DNA为模板,获得Dl AGO6基因的c DNA全长序列,共3 168 bp(登录号为KF819529),完整开放阅读框2 700 bp,编码900个氨基酸。生物信息学分析表明:Dl AGO6的c DNA所编码的氨基酸序列含有2个高度保守的PAZ和PIWI结构域,具有典型的AGO类蛋白的结构特征;与拟南芥AGO6蛋白序列有较高的同源性。龙眼体胚发生过程中Dl AGO6表达量的q PCR分析表明:Dl AGO6在龙眼松散型胚性愈伤组织时期的表达量最高,在鱼雷形胚时期表达量最低,推测DLAGO6在龙眼松散型胚性愈伤组织阶段的高表达量,可能与细胞的旺盛分裂有关。

几种新的FBN1 cDNA片段的克隆及其在马凡综合症基因诊断中的意义

报道3种新的FBN1片段的DNA序列,并分析这些新序列在1例非典型性马凡综合症基因诊断中的参考意义。

犬瘟热病毒南京株 H 蛋白基因的克隆与表达

根据发表的犬瘟热病毒(CDV)参考株Ondetstepoort的序列设计一对引物,以犬瘟热病毒南京株(CDVNJ-15)感染的Vero细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增出1.9kb的全长H蛋白基因,双酶切该全长基因,得到1058bp片段,以正确的阅读框架定向克隆于pET-28b(+)中,然后将重组质粒转化宿主菌RosettaTM,在37℃1.0mmol/LIPTG诱导下获得良好表达。经SDS-PAGE鉴定,表达的融合蛋白质约38kDa,与预期值一致。免疫转印试验显示,该重组蛋白可被CDVOnderstepoort兔抗血清识别,表明该重组蛋白具备部分抗原性。

茶树CsASMT基因的克隆和表达分析

该研究在茶树转录组测序的基础上,以茶树品种‘舒茶早’为试验材料,采用SMARTTM RACE技术,克隆了茶树褪黑素合成途径中关键限速酶N-乙酰基-5-羟色胺甲基转移酶基因(CsASMT)的cDNA全长序列。CsASMT基因序列全长1 282bp,其中包含1 065bp完整开放阅读框(ORF),编码354个氨基酸,预测等电点5.37,蛋白分子量38.98kD。系统进化分析表明,CsASMT与珠美海棠(Malus zumi)ASMT9的亲缘关系最近。将目的基因分别与pET-32a(+)和pMal-c2X载体重组,然后再转化入原核表达菌株BL21(DE3)中,pET-32a(+)/CsASMT在28℃用0.5mg/mL IPTG诱导6h后,以包涵体蛋白的形式表达,而pMal-c2X/CsASMT经诱导后在上清中可获得分子量为79kD大量可溶性融合蛋白。实时定量PCR分析表明,茶尺蠖取食抑制CsASMT基因表达;褪黑素、ABA、MeJA和SA均能够诱导CsASMT基因显著上调表达。该研究结果为N-乙酰基-5-羟色胺甲基转移酶功能研究奠定了一定的基础。

茶树CsSNAT基因的克隆与表达分析

为明确茶树SNAT基因的序列特征和表达特点,在茶树转录组测序的基础上以茶树(Camellia sinensis)品种舒茶早为试验材料,通过SMARTTM RACE技术克隆茶树褪黑素合成途径中关键限速酶5-羟色胺-N-乙酰转移酶CsSNAT基因的cDNA全长序列,并分析其基因结构和表达模式。结果表明,CsSNAT基因序列全长1 014 bp,其中包含742 bp的完整开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸,预测等电点7.64,蛋白分子量27.36 kDa。氨基酸序列比对显示,CsSNAT蛋白与其他高等植物的SNAT蛋白具有较高同源性,与葡萄VvSNAT(CBI31163)同源性最高,为66.19%。诱导蛋白最佳条件为温度28℃,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.5 mg·L-1,诱导时间6 h,在上清液中可获得大量分子量为66 kDa的可溶性融合蛋白。实时定量PCR分析表明,CsSNAT在褪黑素处理6 h后表达量最高,为对照的3倍;茶尺蠖取食6 h后,CsSNAT表达显著上调。不同激素处理结果显示,CsSNAT受脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)诱导表达。本研究结果为5-羟色胺-N-乙酰转移酶功能研究奠定了一定的基础。