115462例新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症筛查及基因突变分析

目的了解贵阳地区葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)缺乏症发病情况和基因突变特点,为贵阳地区G6PD缺乏症的防治提供科学参考。方法募集该地区2020年8月至2023年1月出生的新生儿,应用荧光分析法对其血斑样本进行G6PD酶活性筛查,召回初筛阳性儿,完成G6PD酶活性诊断及多色探针荧光PCR熔解曲线法(Multicolor probe melting curve analysis method,MMCA)基因突变分析。结果共募集115462例新生儿,G6PD酶活性筛查血斑样本共筛出阳性1606例,筛查阳性率为1.39%(1606/115462),其中男性为1.83%(1130/61801)、女性0.89%(476/53661),男女新生儿G6PD酶活性初筛阳性率差异有统计学意义(P<0.01);召回初筛阳性患儿,G6PD基因突变检出率87.07%(909/1044),其中男性为90.09%(764/848),女性为73.98%(145/196),男女间G6PD基因突变检出率差异有统计学意义(P<0.01)。本研究共检出13种类型G6PD基因单一突变型(c.1024 G>T、c.1388 G>A、c.95 A>G、c.1376 G>T、c.592C>T、c.871 G>A、c.519 C>T、c.392G>T、c.493 A>G、c.1004C>A、c.1360C>T、c.383T>C、c.517T>C)和6种复合突变型(c.1376 G>T杂合复合c.95A>G杂合突变、c.1024 G>T杂合复合c.95A>G杂合突变、c.1024 C>T杂合复合c.1388 G>A杂合突变、c.1024 C>T杂合复合c.519C>T杂合突变、c.1376 G>T杂合复合c.1024 C>T杂合突变、c.95A>G杂合复合c.1388 G>A杂合突变)。贵阳地区G6PD缺乏症基因突变类型复杂多样,G6PD突变常见类型为c.1024 C>T、c.1388G>A、c.95 A>G、c.1376G>T这四种类型。结论贵阳地区G6PD基因突变位点具有明显地域性特征,开展G6PD酶活性筛查及相关诊断检测,有利于本地区G6PD缺乏症的筛查、确诊、治疗和防控,有效提高出生人口素质。

基因探针法快速检测食品中金黄色葡萄球菌的研究

[目的]应用Accuprobe基因探针方法快速检测食品中金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。[方法]本实验针对基因探针法检测金葡菌的特异性、敏感性、准确性进行研究,比较该方法与传统国标法的检测结果。[结果]基因探针方法检测食品中金葡菌特异性强,采用增菌肉汤的检测低限为107cfu/ml,检测金葡菌的结果与国标法相一致;对食品中金葡菌鉴定时间仅需30min,简便快捷。[结论]基因探针方法可用于食品中金葡菌的快速检测。

应用FISH法对污水生物处理系统中细菌数量的计数

近年来,FISH(Fluorescence in Situ Hybridization,荧光原位杂交)法作为一种应用分子生物学技术对细胞及细菌等微生物进行定性以及定量分析的研究方法,在国际上得到广泛的应用。本文介绍了应用FISH法对污水处理工艺中细菌数量的计数方法。同时介绍了活性污泥试样制作、FISH法观测试样的制作以及各种试剂的配制、作用以及使用方法,基因探针的选择原则、杂交方法等实际操作方法与过程。

5708例丙型肝炎病毒感染患者基因型检测结果评价

目的研究北京地坛医院丙型肝炎病毒患者基因型检测结果,为临床制定抗病毒治疗个体化方案提供实验室依据。方法选取2015年1月至2019年9月北京地坛医院就诊的丙型肝炎病毒感染患者,采用荧光探针法和基因序列分析法对其基因型进行联合检测。结果采用荧光探针法检测5708例感染者5个基因亚型:lb、2a、3a、3b、6a,占比分别为49.1%、23.1%、3.2%、3.6%、1.9%;在1057例采用荧光探针法检测未分型样本中,35例高于试剂盒各亚型RNA最小检出量,构成比为3.3%,采用测序法进行检测,结果分别为:1a亚型、6n亚型、1b亚型突变、2a亚型突变、3b亚型突变、6a亚型突变,占比为占11.5%、2.8%、54.3%、17.1%、2.8%、11.5%。混合感染的基因型涵盖了1b、3b、2a、3a;1b/2a混合感染8例(浓度相近7例,1b为优势基因型1例);1b/3b混合感染7例(3b为优势基因型7例);2a/3a混合感染1例(浓度相近1例)。结论丙肝病毒不同基因型混合感染率为0.3%,不同基因型混合感染的优势基因型不同;当检测的丙肝病毒基因型突变位点位于引物和探针区域或荧光探针无法覆盖其亚型时,用荧光探针法无法检出,基因序列分析法可作为其有效补充。

胜利油田外排水中铁细菌主要类群的检测及群落结构分析

根据油田外排水中常见铁细菌的16SrRNA特异性保守序列，设计和合成了4种荧光探针，利用荧光原位杂交方法，分别利用它们对胜利油田孤岛采油厂、胜利采油厂1号和2号综合处理站外排水中存在的铁细菌的种类和数量进行检测，分析了各外排水中铁细菌的群落结构．结果表明，利用基因探针能快速对胜利油田外排水中的铁细菌进行检测：在孤岛采油厂、胜利采油厂1号和2号综合处理站的外排水中，利用4种探针的组合探针检测到的铁细菌细胞数量分别占样品中微生物总细胞数量的11．0％、12．8％和9．0％，其中Leptothrix和Sphaerotilus，以及Leptospirillum ferriphilum为胜利油田外排水中的3种优势铁细菌，分别占水样中总微生物细胞数的2．94％±0．52％～3．39％±0．52％和2．24％±0．16％-2．63％±0．49％；而Leptospirillum ferrooxidans和Acidithiobacillus spp．的种群则较小．3个污水处理站中铁细菌群落结构差异较大，而多样性相差不大．利用4种探针的各种组合对外排水中铁细菌的检测表明，单探针能够很好地分析外排水中铁细菌的群落结构，而组合探针能快速、较准确地检测外排水中铁细菌的数量，比传统的绝迹稀释法具有快速、准确、直观等优点．

不同代次羊驼皮肤黑素细胞TYR基因表达变化的研究

为了探讨TYR基因在体外培养的羊驼皮肤黑素细胞不同代次间表达变化差异,根据Gen Bank中已发现的序列(EU293064)设计引物和探针,以羊驼皮肤黑素细胞的RNA为模板,采用QRT-PCR Taq Man探针法研究羊驼酪氨酸酶基因在不同代次间羊驼皮肤黑素细胞中m RNA表达量.结果表明,经过内参基因校正后,第10代羊驼黑素细胞中TYR基因的相对表达量是第3代细胞相对表达量的25倍(P<0.01),第10代细胞与第5代细胞表达差异不明显(P>0.05)。表明TYR基因表达量的差异与羊驼皮肤黑素细胞传代可能存在一定的相关性。

塔什库尔干羊FecB基因非探针法高分辨率熔解曲线分型方法的研究

建立塔什库尔干羊FecB基因非探针法高分辨率熔解曲线分型方法,为塔什库尔干羊多胎类型选育奠定基础。试验选取塔什库尔干羊产双羔(多羔)母羊67只,双羔(多羔)羔羊136只,采集静脉血后,采用非探针法高分辨率熔解曲线对探究塔什库尔干羊FecB基因进行分型的条件。结果表明,115bp扩增引物聚合性以及温度的一致性较好,适合SNP位点的分型,且引物添加量为0.6μL时扩增效率较较好。镁离子浓度在2.4~3.2mmol/L时,扩增曲线和熔解曲线聚合性较好,反应模板浓度在50ng时,扩增曲线、熔解曲线和熔解温度差异曲线较符合塔什库尔干羊FecB基因分型的要求。通过使用优化路线,进行塔什库尔干羊FecB基因分型发现,母羊和羔羊不携带纯合型(BB),携带杂合型(B+)母羊占31.3%,羔羊占25.7%;携带野生型的母羊占68.7%,羔羊占74.3%。。可见,通过建立FecB基因非探针法高分辨率熔解曲线分型方法,筛选较优反应条件,可提高塔什库尔干羊多胎新品系培育的选种效率和选种准确性。

Au纳米颗粒HBV DNA基因探针的制备及其在目视化检测HBV DNA中的应用

制备金(gold,Au)纳米颗粒乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(hepatitis B virus deoxynucleic acid,HBV DNA)基因探针,研究其在目视化检测HBV DNA中的应用。Au纳米颗粒通过金-硫(Au-S)共价键结合烷氢硫醇修饰的寡核苷酸,制备检测探针。用荧光标记法检测Au纳米颗粒表面寡核苷酸的覆盖率和与其互补的寡核苷酸的杂交效率。检测探针与固定在尼龙膜上的捕捉探针构成双探针,用斑点杂交法检测HBV DNA,加入银离子(Ag+)-对苯二酚液染色观察结果。制备的Au纳米颗粒粒径为(12±5)nm,分散良好,在520nm有最大吸收峰,经寡核苷酸修饰后,最大吸收峰改变为524nm。Au纳米颗粒表面寡核苷酸的最大覆盖率为(132±10)条,最大杂交效率为(22±3)%。在尼龙膜上用斑点杂交法可检出低至10fmol的合成靶DNA,可目视化检出乙肝患者血清中HBV DNA的PCR产物。Au纳米颗粒HBV DNA基因探针可用于目视化检测HBV DNA,此方法具有敏感性高、特异性好、简单、价廉的特点,可望在许多领域,尤其是在多基因检测芯片上有潜在的应用价值。

鸭腺病毒A型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

试验旨在建立鸭腺病毒A型(duck adenovirus A,DAdV-A)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和常规PCR方法同时对福建地区临床收集的85份番鸭源病料进行DAdV-A感染的检测,比较其符合率。结果表明,试验成功建立了检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,其扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.9%;特异性强,对鸭常见病原(如鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;灵敏度高,最低检测限为8.37拷贝/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.54%~1.28%和0.61%~2.39%。对临床送检的85份病料,TaqMan实时荧光定量PCR方法的阳性率为7.06%(6/85),PCR方法的阳性率为5.88%(5/85),且PCR检测的阳性样品经TaqMan实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,为鸭群中开展DAdV-A的分子流行病学研究提供了有效技术手段。

加工鳗鱼制品中单增李斯特氏菌的基因探针鉴定及分析

从10份鳗鱼制品中分离到4株单增李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)的可疑菌株,应用Accuprobe基因探针方法进行快速鉴定,鉴定结果与APIListeria方法的鉴定结果进行比较。结果表明,基因探针鉴定方法更简便、快速、准确,缩短了检验鉴定周期。检测鉴定结果也表明,加工过的鳗鱼产品仍然存在被单增李斯特氏菌污染的可能,应引起生产及监管部门的高度重视,防止食物中毒的爆发流行。

鸟枪法筛选枯草芽孢杆菌基因强启动子及对黄牛GHRL基因的表达

利用鸟枪法通过大肠埃希菌-枯草芽孢杆菌启动子探针载体分离到枯草芽孢杆菌168菌株的103个基因启动子片段,发现1个672 bp的启动子片段P3.4.23,能够在大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌高效启动报告基因β-半乳糖苷酶的表达,其酶活性分别达到3 418、2 877 U/mL.相似性分析表明P3.4.23启动子片段具有枯草芽孢杆菌基因启动子的保守序列,并确定其转录活性区域位于5～333 bp,为yxiE基因的调控序列.将黄牛GHRL基因导入到启动子亚克隆序列下游,使该基因在枯草芽孢杆菌中得到了表达.

鸭瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立

根据鸭瘟病毒(DEV) gE基因的特征,设计特异性引物和探针,经条件优化后,建立检测DEV的TaqMan实时荧光定量PCR方法.结果表明:当gE基因含量为1.0×10~1～1.0×10~6拷贝·μL^(-1)时,建立的实时荧光定量PCR检测方法有良好的线性扩增,其标准曲线方程为:y=-3.480x+37.955,扩增相关系数为0.999;敏感性强,最低检测限为10拷贝·μL^(-1);特异性好,仅对DEV强毒株和弱毒活疫苗株检测到阳性扩增信号,对鸭源其他传染病病原(番鸭细小病毒、鹅细小病毒、鸭腺病毒A型、鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒、新型鸭呼肠孤病毒、H9N2亚型禽流感病毒、禽1型副粘病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.62%～1.14%和0.69%～2.40%.对临床送检疑似DEV感染的14份样品进行检测,并与常规PCR方法、病毒分离鉴定进行比较,阳性率分别为85.71%(12/14)、71.43%(10/14)和57.14%(8/14);且与常规PCR方法、病毒分离鉴定的阳性符合率均为100%.本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法,可用于开发DEV快速诊断试剂盒,用于开展DEV流行病学调查.

超级细菌bla_(NDM-1)基因TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测超级细菌编码新德里金属β-内酰胺酶1(NDM-1)的bla_(NDM-1)基因的方法,本研究针根据bla_(NDM-1)及其变异体的基因序列设计一对特异性引物和一条MGB探针,以构建的含有bla_(NDM-1)基因片段的重组质粒作为阳性标准品,经条件优化,建立了检测bla_(NDM-1)基因的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。结果显示该方法可以特异性扩增bla_(NDM-1)基因重组质粒标准品,而对鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的标准菌株扩增均为阴性;检出下限为2.59拷贝/μL,比常规PCR敏感性高100倍;组内及组间重复性试验的变异系数均小于1.5%。利用所建立的方法对34株鸡源致病性沙门氏菌分离株进行检测,结果均未检测到目的片段,表明所有分离株均未携带bla_(NDM-1)基因。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于监测携带bla_(NDM-1)基因及其变异体的超级细菌。

一种基于CP530R序列非洲猪瘟病毒TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、敏感和特异地检测非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）的方法，试验根据ASFV CP530R基因序列设计1对特异性引物和探针，通过优化反应条件，建立了一种检测ASFV的TaqMan—MGB探针实时荧光PCR方法，并对该方法进行了特异性、定量线性范围、敏感性和重复性等试验评价。结果表明：该方法仅对ASFV发生特异性扩增反应，不与伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）和猪圆环病毒2型（PCV-2）、经典猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪流感病毒（SIV）发生交叉反应，具有良好的特异性。用该方法检测质粒标准对照（PCR2．1-ASFV—CP530R）的线性范围为6．1×10^2-6．1×10^9copies／μL，标准曲线方程为Y=-3．449x＋38．10，相关系数（R^2）为0．999，最低可检测到61个拷贝的质粒标准对照分子；对5个不同浓度（6．1×10^3-6．1×10^7copies／μL）的质粒标准对照进行双份样品的4次重复检测，每个浓度质粒标准对照的D值变异系数均小于2．0％，具有良好的重现性；用该方法对126份进口猪的血液样品和38份猪肉样品进行ASFV检测，结果均为阴性。说明本方法可用于活猪临床样品和生猪样品中ASFV的检测。

绵羊主效基因FecB的检测与肉用多羔核心群的建立

基于前期本实验室建立的绵羊多羔性状主效基因FecB高通量检测技术(TaqMan探针法),对10个绵羊群体的16460只绵羊进行了多羔性状主效基因FecB的检测,结果发现小尾寒羊、湖羊以及滩羊的B等位基因频率与前人实验结果一致,有些群体经过长期选择已处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P<0.05);本课题组与多个企业经过长期努力已建立了多个肉用多羔绵羊核心群,通过比较发现BB型绵羊产羔数极显著高于B+型,B+型极显著高于++型,且高繁殖力核心群3种FecB基因型小尾寒羊产羔数高于普通小尾寒羊群体。绵羊多羔性状主效基因FecB的检测和肉用多羔绵羊核心群的建立为绵羊群体改良提供了支撑。

基因芯片法与线性探针法对痰标本中结核分枝杆菌检测的应用价值

目的探讨基因芯片法与线性探针法检测痰标本中结核分枝杆菌(MTB)的应用价值。方法海南医学院第二附属医院2018年3—7月门诊和住院的106例疑似肺结核患者纳入研究,采用基因芯片法、线性探针法对患者送检的痰进行检测,并与改良罗氏培养法进行比较;以比例法药敏试验为金标准,分析上述两种方法检测利福平和异烟肼耐药性的效能。结果对106份痰标本进行改良罗氏培养,阳性率为52.83%(56/106),经鉴定其中46份标本为MTB阳性。基因芯片法和线性探针法分别检出MTB46、53株,基因芯片法、线性探针法与改良罗氏培养法检测MTB结果比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。基因芯片法、线性探针法与比例法检测MTB对利福平的耐药性比较,差异均无统计学意义,且具有较好一致性(均P>0.05,均Kappa>0.75)。对利福平的耐药性检测,基因芯片法的灵敏度、特异度分别为84.62%、90.00%,线性探针法分别为84.62%、85.00%。基因芯片法、线性探针法与比例法检测MTB对异烟肼的耐药性比较,差异均无统计学意义,但一致性一般(均P>0.05、均Kappa<0.75)。对异烟肼的耐药性检测,基因芯片法的灵敏度、特异度分别为69.23%(18/26)、95.00%(19/20),线性探针法分别为65.38%(17/26)、85.00%(17/20)。结论基因芯片法和线性探针法均可准确、快速地从大部分疑似结核病患者的痰标本中鉴定出MTB,也适用于利福平和异烟肼耐药结果的快速检测,从而指导临床用药,值得临床推广。

不同方法检测遂宁市MTHFR C677T基因多态性效果比较

目的采用TaqMan-MGB探针法与微测序法检测遂宁市女性亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T基因多态性的分布特征,并进行比较分析。方法选取到遂宁市中心医院进行孕前与孕期检查的无亲缘关系女性1972例作为研究对象,通过TaqMan-MGB探针法进行MTHFR C677T基因多态性检测,统计分析该地区MTHFR C677T基因多态性的分布特征,并与其他地区数据进行比较。另随机选择68例样本,以微测序法检测MTHFR C677T基因多态性,对其分布特征进行比较分析。结果遂宁市女性MTHFR C677T基因CC型、CT型和TT型频率分别为42.9%、45.0%、12.1%,以CC型和CT型为主。遂宁市分布特征与昆明、德阳、湘潭地区基因型比较,差异均无统计学意义(P>0.05);与郑州、廊坊、烟台、延边、乌鲁木齐、镇江、荆州、惠州、淄博、临沂、武汉、广州、琼海、松滋、西安、尚志、郫县地区比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。TaqMan-MGB探针法与微测序法检测的分布频率具有高度一致性,CC型、CT型和TT型符合率均为100.0%。结论遂宁市女性MTHFR C677T基因多态性分布不同于其他地区,具有地域特异性。微测序法技术准确、检测效率高,适用于临床实验室基因多态性的快速筛检。

两种方法浓缩污水水样及HBV-DNA基因探针检测

采用滑石粉-硅藻土浓缩法和Al_2(SO_4)_3·18H_2O浓缩法,浓缩某医院经处理的污水水样,并用基因探针检测该污水水样中的乙型肝炎病毒。将污水水样浓缩液点在硝酸纤维素膜上,再用HBV-DNA基因探针进行杂交。经放射自显影,结果表明,用Al_2(S0_4)_3·18H_2O浓缩法浓缩的经处理污水水样中发现有乙型肝炎病毒存在,其阳性率为50％;而用滑石粉-硅藻土浓缩法浓缩的经处理污水水样中未发现有乙型肝炎病毒。

基于高区别因子自组装三臂DNA纳米探针检测人体多重耐药基因

建立了一种新的基于高区别因子三臂DNA纳米探针的荧光分析法检测人体多重耐药(MDR)基因。此探针由保护链P1和互补链C1与信号报告部分(信号链S1和信号链S2)组成:P1与修饰了荧光猝灭基团Dabcyl的S1及C1部分碱基杂交;修饰了荧光基团FAM的S2与C1另一部分碱基杂交。探针内部Dabcyl和FAM相互靠近,荧光猝灭。当MDR基因存在时,其与三臂DNA纳米探针发生链替代反应,释放荧光信号。在最优条件下,单碱基错配产生的微小的热力学改变即可影响该探针链替代效率,从而实现高特异性检测MDR基因和其点突变基因(2m、3m、3d、5m、5d)。该探针对不同突变位点及同一突变位点的不同突变类型MDR基因均展现出良好的特异性,其检测3d的区别因子达到24.1,平均区别因子达到11.8。在混合人血清中,MDR基因的回收率为99.0%~101.7%。此外,本方法通用性好,不需要重新设计S1和S2即可实现对miR-21的特异性检测。

2种结核分枝杆菌耐药基因突变检测方法诊断利福平耐药结核病的评估研究

目的评价荧光定量PCR探针熔解曲线法(简称Melt PCR法)和Gene Xpert MTB/RIF技术(简称Xpert法),用于临床涂阳标本诊断利福平耐药结核病(Rifampicin resistant tuberculosis,RR-TB)的检测效能及应用价值。方法随机收集2016年2月至2018年6月在河北省胸科医院就诊肺结核患者结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)涂阳标本278例,应用传统的结核菌比例法药敏试验(对照检测方法)、Melt PCR法和Xpert法同时进行RR-TB情况的检测,分析Melt PCR法和Xpert法检测RR-TB的效能。结果3种方法同时对278例MTB阳性标本的利福平耐药进行检测,耐药检出结果差异无统计学意义(P>0.05)。与传统药敏试验结果相比,Melt PCR法和Xpert法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度和约登指数分别为97.96%、98.25%、92.31%、99.56%、98.20%、96.21%和95.92%、97.38%、88.68%、99.11%、97.12%、93.30%,Kappa值分别为0.940和0.904(P<0.05),均为高度一致。3种方法在痰液中的利福平耐药均显著高于支气管肺泡灌洗液,且差异具有统计学意义(P<0.05)。不同带菌量样本的利福平耐药检出结果差异无统计学意义(P>0.05)。结论Melt PCR法和Xpert法用于临床涂阳标本中检测RR-TB具有相似的高灵敏度和特异度等检测性能,可结合实际需求在耐多药结核病防治中推广和应用。