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A novel strategy for construction of immuno-PCR gene probe and its preliminary application in diagnosis
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作者 乔生军 吴自荣 +1 位作者 戚蓓静 王林发 《Science China(Life Sciences)》 SCIE CAS 1998年第1期18-23,共6页
An α fetoprotein (AFP) antibody gene probe was constructed using chlorophyll molecule as a coupler between protein and dsDNA. The preliminary study on the detection of AFP using this novel probe was performed by immu... An α fetoprotein (AFP) antibody gene probe was constructed using chlorophyll molecule as a coupler between protein and dsDNA. The preliminary study on the detection of AFP using this novel probe was performed by immuno PCR, and the results indicated that the sensitivity of the gene probe by immuno PCR is 10 4-10 5 times higher compared with ELISA. The construction of immuno PCR gene probe in this way not only completely prevents the protein from contacting with organic solvent and maintains the native conformation of the proteins, but also anchors protein to dsDNA in a fixed orientation and makes PCR amplification more efficient. The gene probe thus constructed is stable for at least 6 months at room temperature. This new approach is exquisite, simple, less expensive, and suitable to a variety of applications. 展开更多
关键词 CHLOROPHYLL gene probe IMMUNO pcr ANTIBODY antigen.
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Genetic Diversity in the Camel Tick <i>Hyalomma dromedarii</i>(Acari: Ixodidae) Based on Mitochondrial Cytochrome c Oxidase Subunit I (COI) and Randomly Amplified Polymorphic DNA Polymerase Chain Reaction (RAPD-PCR)
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作者 Mohammad Ali Al-Deeb Mohamed Rizk Enan 《Advances in Entomology》 2018年第4期285-294,共10页
Hyalomma dromedarii ticks are important disease vectors to camels in the UAE and worldwide. Ticks can be identified using DNA-based techniques. In addition, such techniques could be utilized to study the intraspecific... Hyalomma dromedarii ticks are important disease vectors to camels in the UAE and worldwide. Ticks can be identified using DNA-based techniques. In addition, such techniques could be utilized to study the intraspecific genetic diversity in tick populations. In this study, the genetic diversity of four H. dromedarii populations was investigated using mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (COI) gene and randomly amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction (RAPD-PCR). The results showed that both of the aforementioned techniques produced similar grouping patterns. Moreover, they revealed that the four tick populations had high levels of genetic similarity. However, one population was slightly different from the three other populations. The current study demonstrated that H. dromedarii ticks in the UAE are very similar at the genetic level and that investigating more locations and screening larger numbers of ticks could reveal larger genetic differences. 展开更多
关键词 CAMEL TICK genetic Diversity COI gene rapd-pcr Hyalomma dromedarii
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鸡滑液囊支原体TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立及应用 被引量:1
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作者 李梅 王柏林 +6 位作者 岳筠 杨美 宋春 朱二鹏 单春兰 文明 程振涛 《动物医学进展》 北大核心 2023年第3期15-20,共6页
为了快速、准确检测鸡滑液囊支原体(MS),对MS标准株vlhA基因进行分析,设计并合成特异性引物和探针,优化反应条件,构建了基于vlhA基因的TaqMan实时荧光定量PCR快速检测方法。结果显示,所构建方法标准曲线所对应的相关系数R^(2)=1.000,斜... 为了快速、准确检测鸡滑液囊支原体(MS),对MS标准株vlhA基因进行分析,设计并合成特异性引物和探针,优化反应条件,构建了基于vlhA基因的TaqMan实时荧光定量PCR快速检测方法。结果显示,所构建方法标准曲线所对应的相关系数R^(2)=1.000,斜率S=-3.452,截距I=43.950,表明标准质粒浓度与Ct值的线性关系良好;该方法除MS外,其他参考菌(毒)株均无目的基因扩增,其最小检测浓度为1×10^(1)copies/μL,组内重复及组间重复的变异系数均低于0.1;运用所建立方法与普通PCR方法对4份疑似MS临床样本进行检测,检测结果完全相符合;应用该方法对贵州省7个地区107份疑似MS样本进行检测,发现总体阳性率为26.17%。说明建立的方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床检测。 展开更多
关键词 鸡滑液囊支原体 vlhA基因 TAQMAN探针 实时荧光定量pcr
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马疱疹病毒8型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立
4
作者 纪言霏 齐来勇 +4 位作者 张健鹏 许丹丹 张敬文 赵霞 刘文强 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2023年第8期24-28,共5页
为了建立一种能够快速检测马疱疹病毒8型(EHV-8)的方法,本试验以EHV-8的全基因组序列为模板,针对糖蛋白B(gB)基因的保守序列,进行对比分析,设计EHV-8的特异性引物和探针,优化反应条件,建立EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对该... 为了建立一种能够快速检测马疱疹病毒8型(EHV-8)的方法,本试验以EHV-8的全基因组序列为模板,针对糖蛋白B(gB)基因的保守序列,进行对比分析,设计EHV-8的特异性引物和探针,优化反应条件,建立EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行验证,使用该方法进行临床样本检测。结果显示,建立的EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法对EHV-8 DNA模板的最低检测限为1.1×10^(2)copies/μL,敏感性高;EHV-8与EHV-1、EHV-4、马流产沙门氏菌和肠产毒性大肠杆菌均无交叉反应,特异性强;批内重复性试验和批间重复性试验均表明该方法重复性好。对132份临床样本的检测结果显示,阳性检出率为10.61%,基因测序正确。由此可见,本试验建立的EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法能够满足EHV-8的检测需求,且该方法敏感性高、特异性强、重复性好,为EHV-8的进一步研究提供了有效的辅助检测手段。 展开更多
关键词 马疱疹病毒8型 糖蛋白B(gB)基因 实时荧光定量pcr TAQMAN探针
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基于实时荧光定量PCR的番木瓜多重PCR高效检测方法 被引量:1
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作者 张玉山 陈洁彬 +3 位作者 吴亮君 朱璇 欧阳淑芬 沈志华 《湖北农业科学》 2023年第9期170-174,共5页
以pCaMV35S基因核酸检测试剂盒反应体系为基础,添加多重PCR反应所需的目标基因引物和番木瓜(Carica papaya L.)DNA,进行多重PCR反应,同时考察不合成荧光探针的情况下对目标基因进行实时荧光定量检测。结果表明,在实时荧光定量PCR反应体... 以pCaMV35S基因核酸检测试剂盒反应体系为基础,添加多重PCR反应所需的目标基因引物和番木瓜(Carica papaya L.)DNA,进行多重PCR反应,同时考察不合成荧光探针的情况下对目标基因进行实时荧光定量检测。结果表明,在实时荧光定量PCR反应体系中,多重PCR扩增的基因条带比常规PCR扩增的基因条带更亮,在不合成荧光探针的情况下实现目标基因的实时荧光定量PCR反应,以期建立一种基于实时荧光定量PCR的多重PCR检测方法。 展开更多
关键词 转基因番木瓜(Carica papaya L.) 多重pcr反应 实时荧光定量pcr 荧光探针 pCaMV35S基因核酸检测试剂盒(pcr-荧光探针法)
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基于TaqMan MGB探针的人粪便中华支睾吸虫虫卵实时荧光PCR检测方法的建立及应用
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作者 马文晨 杨迪 +2 位作者 于欣 赵欣玥 李文君 《寄生虫与医学昆虫学报》 CAS 2023年第3期143-147,共5页
本研究根据华支睾吸虫cox 1基因序列设计合成特异性引物和探针,建立基于TaqMan MGB探针的人粪便中华支睾吸虫虫卵实时荧光PCR检测方法,同时评价该方法的特异性、敏感性、重复性。采用建立的荧光PCR方法对临床样本进行检测,并与改良加藤... 本研究根据华支睾吸虫cox 1基因序列设计合成特异性引物和探针,建立基于TaqMan MGB探针的人粪便中华支睾吸虫虫卵实时荧光PCR检测方法,同时评价该方法的特异性、敏感性、重复性。采用建立的荧光PCR方法对临床样本进行检测,并与改良加藤厚涂片法检测结果进行比对。结果显示,本研究建立的方法与形态和种属关系相近的寄生虫无交叉反应;以9.97×10^(7)~9.97×10^(0)copies/μL浓度的质粒作为标准品建立标准曲线,检测灵敏度为9.97 copies/μL;组内、组间重复性试验变异系数均小于0.4%。采用该方法检测280份居民粪便样本,检出阳性54份,经对比该方法敏感性高于改良加藤厚涂片法。本研究所建立的方法可用于华支睾吸虫虫卵的检测及诊断。 展开更多
关键词 华支睾吸虫 虫卵 cox 1基因 TaqMan MGB探针 实时荧光pcr
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基因探针和PCR方法在菌痢流行病学研究中的应用 被引量:3
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作者 夏桂枝 叶礼燕 +2 位作者 王红 白石山 俞守义 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2004年第12期1062-1064,1067,共4页
目的 探讨基因探针和PCR方法在F2a志贺氏菌痢暴发的流行病学研究中的意义。方法 对 4 3株自患者粪便和食物中分离到的F2a志贺氏菌进行 16srRNA、ipaH基因Southern杂交 ,随机PCR和set1/set2毒力基因PCR分析。 结果 随机PCR、ipaH基因S... 目的 探讨基因探针和PCR方法在F2a志贺氏菌痢暴发的流行病学研究中的意义。方法 对 4 3株自患者粪便和食物中分离到的F2a志贺氏菌进行 16srRNA、ipaH基因Southern杂交 ,随机PCR和set1/set2毒力基因PCR分析。 结果 随机PCR、ipaH基因Southern杂交将 4 3株F2a志贺氏菌分为两个不同的基因型 ,set1/set2毒力基因PCR分为三个不同的基因型 ,16srRNA基因Southern杂交均为同一基因型。结论 基因分型方法能更准确、深入地揭示菌痢暴发过程中各分离株之间的流行病学联系。其中set1/set2毒力基因PCR方法具有较高的分辨率 ,在F2a志贺氏菌的分子流行病学研究中具有重要的作用。 展开更多
关键词 志贺氏菌 基因探针 随机pcr 志贺氏肠毒素
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toxR基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测副溶血弧菌 被引量:28
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作者 覃倚莹 吴晖 +4 位作者 肖性龙 杨晓泉 张经纬 余以刚 李惠芳 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期1837-1842,共6页
以toxR基因为靶基因,通过优化反应条件建立了快速检测副溶血弧菌的TaqMan实时荧光PCR方法。特异性试验表明,该方法能选择性检测副溶血弧菌,而与金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特杆菌等多种常见的食源性病原菌没有交叉反应;灵敏度... 以toxR基因为靶基因,通过优化反应条件建立了快速检测副溶血弧菌的TaqMan实时荧光PCR方法。特异性试验表明,该方法能选择性检测副溶血弧菌,而与金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特杆菌等多种常见的食源性病原菌没有交叉反应;灵敏度试验表明,该方法最少可检测到25个拷贝的toxR基因重组质粒,对纯培养物和模拟食品样品直接检测的灵敏度分别为21 cfu/mL和210 cfu/g;重复性试验表明,同一样品于试验内及试验间的变异系数分别为0.9%和1.3%;所制作的标准曲线在2.5×101~2.5×106拷贝数之间有较好的线性关系,能对副溶血弧菌进行准确的定量分析。结果表明,本研究所建立的副溶血弧菌实时荧光PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,能进行定量检测,而且检测时间从核酸抽提到出实验结果仅需要3 h,是快速检测副溶血弧菌的有效手段。 展开更多
关键词 副溶血性弧菌 实时荧光定量pcr toxR基因 TAQMAN探针 检测
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嗜肺军团菌荧光定量PCR检测 被引量:17
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作者 朱水荣 张政 +3 位作者 卢亦愚 任红宇 扬仕贵 高晓萍 《中国公共卫生》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期1111-1113,共3页
目的建立特异、快速、敏感的TaqMan探针荧光定量PCR方法,用于检测嗜肺军团菌mip基因。方法嗜肺军团菌及其他军团菌DNA模板来自中国疾病预防控制中心呼吸道室,嗜肺军团菌地方株及其他对照株由本中心菌种室供给。利用嗜肺军团菌mip基因保... 目的建立特异、快速、敏感的TaqMan探针荧光定量PCR方法,用于检测嗜肺军团菌mip基因。方法嗜肺军团菌及其他军团菌DNA模板来自中国疾病预防控制中心呼吸道室,嗜肺军团菌地方株及其他对照株由本中心菌种室供给。利用嗜肺军团菌mip基因保守序列设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量PCR反应条件和反应体系进行优化,并对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性等。结果该方法在检测多株嗜肺军团菌时,均出现阳性信号,而对非嗜肺军团菌和其他细菌则未有阳性扩增结果出现。检测灵敏度达10个拷贝/反应,从菌株核酸的提取至检测完成仅需2 h左右,可减少常规PCR操作的污染机会。结论TaqMan荧光定量PCR方法可定量检测嗜肺军团菌,具有特异性高、快速、敏感等特点,适于外环境污染源状况的调查及应急事件的快速定量检测。 展开更多
关键词 嗜肺军团菌 MIP基因 TAQMAN探针 荧光定量pcr
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PCR和核酸探针检测猪源沙门氏菌四环素耐药基因tetC的研究 被引量:15
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作者 代敏 王红宁 吴琦 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期482-485,共4页
对沙门氏菌的四环素耐药性进行了检测,结果表明,沙门氏菌对四环素类抗生素产生了广泛的耐药性,耐药率达100%,对其四环素耐药基因tetC进行了扩增,结果获得以质粒为模板的特异性产物,与药敏试验结果阳性符合率75%,具有较高的检出率。用光... 对沙门氏菌的四环素耐药性进行了检测,结果表明,沙门氏菌对四环素类抗生素产生了广泛的耐药性,耐药率达100%,对其四环素耐药基因tetC进行了扩增,结果获得以质粒为模板的特异性产物,与药敏试验结果阳性符合率75%,具有较高的检出率。用光生物素对PCR产物进行标记,制备核酸探针,采用菌落原位杂交的方法对沙门氏菌进行检测,结果表明13株阳性、3株阴性,杂交结果与PCR结果阳性符合率为93.75%,具有较高的特异性。通过条件的优化,建立的四环素耐药基因tetC的PCR和核酸探针检测技术,为四环素耐药性的分子流行病学监测提供了有效的途径。 展开更多
关键词 沙门氏菌 TETC 耐药基因 核酸探针 pcr 四环素类抗生素 流行病学监测 pcr产物 耐药性 试验结果 原位杂交 检测技术 特异性 符合率 耐药率 阳性 检出率 生物素 药敏
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Taqman-MGB双重探针PCR技术检测含89K毒力岛猪链球菌2型 被引量:9
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作者 朱水荣 王志刚 +4 位作者 杨婷婷 金大智 张政 徐宝祥 姚萍萍 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期434-438,共5页
目的建立同时检测猪链球菌(Streptococcus suis,SS)种特异性16S rRNA及其89K毒力岛基因的SS2中国毒力株双重荧光定量PCR方法。方法利用SS种特异性16S rRNA和89K毒力岛基因的特异性序列设计引物和MGB探针。优化荧光定量PCR反应条件和反... 目的建立同时检测猪链球菌(Streptococcus suis,SS)种特异性16S rRNA及其89K毒力岛基因的SS2中国毒力株双重荧光定量PCR方法。方法利用SS种特异性16S rRNA和89K毒力岛基因的特异性序列设计引物和MGB探针。优化荧光定量PCR反应条件和反应体系,并对21株猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)、18株其它链球菌、9株葡萄球菌、5株其它菌株进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果该技术的种特异性16S rRNA及其89K毒力岛两基因检测灵敏度分别为6个拷贝/反应(或12cfu/mL)及27拷贝/反应(或58cfu/mL);重复性实验,变异系数为0.30%~2.11%;从菌株核酸的提取至检测完成仅需2h左右。用该方法对有关菌株进行考核,21株SS2菌检测结果均为SS种特异性16S rRNA基因阳性,其中15株含有89K毒力岛的SS2菌株的89K毒力岛基因检测均阳性;而非SS菌株的16S rRNA和89K毒力岛基因检测结果均为阴性。对49份呼吸道咽拭子、血液应急样本等进行实际考核,有2份血液样本16S rRNA基因阳性,其中1份血液样本89K毒力岛基因阳性。结论本次建立的Taq Man-MGB双重探针荧光定量PCR方法特异、快速、敏感,可特异性鉴定SS2中国毒力株(含有89K毒力岛),区分SS与非SS菌以及是否含有89K毒力岛基因,该方法的建立将有益于目前针对猪链球菌2型中国毒力株快速定量检测,以及疑似猪链球菌病患者病原的早期甄别、猪链暴发疫情调查及猪群暴发或带菌调查与评估等。 展开更多
关键词 猪链球菌2型 双重荧光定量pcr MGB探针 16S RDNA基因 89K毒力岛
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基因探针和PCR对鲤吉陶单极虫的检测 被引量:6
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作者 陶增思 黎诚耀 +4 位作者 卢强 王振英 张西臣 汪建国 李德昌 《中国兽医学报》 CAS CSCD 1996年第6期580-584,共5页
采用液氮冷冻研磨法破碎吉陶单极虫(Thelohaneluskitauei)孢子,按常规法提取其基因组DNA。取DNAEcoRI消化产物,采用低熔点琼脂糖回收法制备大(3.0~15.0kb)、小(0.5~3.0kb)片... 采用液氮冷冻研磨法破碎吉陶单极虫(Thelohaneluskitauei)孢子,按常规法提取其基因组DNA。取DNAEcoRI消化产物,采用低熔点琼脂糖回收法制备大(3.0~15.0kb)、小(0.5~3.0kb)片段,将其克隆于pBluescriptksEcoRI位点,经α-互补现象、酶切鉴定和虫体DNA生物素标记探针筛选,构建了含23个克隆的基因文库,克隆片段介于0.9~6.8kb之间;经阳性克隆标记筛选及特性分析,制备了长度为0.9kb(19号质粒克隆片段)的探针,该探针具有较强的敏感性和特异性。对该探针两端DNA序列进行分析,设计出1对引物。上游引物序列为:5′TTTCGAACCCGCACAACAAG3′,下游引物序列为:5′TGAGTGGATAG-TATCGCTGC3′。 展开更多
关键词 吉陶单极虫 基因文库构建 基因探针 pcr
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荷斯坦牛耐热性RAPD和SCAR标记的研究 被引量:4
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作者 苏光华 胡雄贵 +2 位作者 燕海峰 肖兵南 张元跃 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期1278-1284,共7页
以52头高产耐热组和41头高产不耐热组中国荷斯坦牛的DNA为材料,选用200条RAPD引物,利用RAPD-PCR技术,对荷斯坦牛的耐热性进行研究。结果发现,使用S441引物和S463引物在高产耐热组中分别发现了581 bp(RAPD-S441标记)和680 bp(RAPD-S463标... 以52头高产耐热组和41头高产不耐热组中国荷斯坦牛的DNA为材料,选用200条RAPD引物,利用RAPD-PCR技术,对荷斯坦牛的耐热性进行研究。结果发现,使用S441引物和S463引物在高产耐热组中分别发现了581 bp(RAPD-S441标记)和680 bp(RAPD-S463标记)2条特异性片段。通过测序和序列比较显示:581 bp的片段与KCNN2基因的同源性达90%;680 bp片段与NW_001024067.1|BtUn_WGA9442_2的同源性达99%。根据已知KCNN2基因的功能,初步判断KCNN2基因为影响耐热性能的候选基因。得到GenBank登录号EF123743和EF123744。利用NCBI的ORF finder在581 bp中没有发现ORF,与预测其是KCNN2基因内含子3的结论相符合。在680 bp中发现4个开放阅读框(ORF),分别为ORF1、ORF2、ORF3、ORF4。这4个阅读框分别编码48AA、34AA、45AA、34AA。根据RAPD-S441、RAPD-S463标记的测序结果,利用Premier 5.0软件设计对应的SCAR引物。成功将RAPD-S441标记转化为耐热SCAR标记。 展开更多
关键词 荷斯坦 耐热性 rapd-pcr KCNN2基因
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黏菌素耐药基因mcr-1 TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立 被引量:8
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作者 施开创 尹彦文 +3 位作者 温丽霞 屈素洁 王海清 胡杰 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期1447-1452,共6页
【目的】建立针对黏菌素耐药基因mcr-1的Taq Man-MGB荧光定量PCR检测方法,为监控mcr-1基因携带细菌提供技术支持。【方法】针对mcr-1基因保守序列设计特异性引物和MGB探针,构建重组质粒作为阳性标准品,优化引物、探针浓度及Rox参比染料... 【目的】建立针对黏菌素耐药基因mcr-1的Taq Man-MGB荧光定量PCR检测方法,为监控mcr-1基因携带细菌提供技术支持。【方法】针对mcr-1基因保守序列设计特异性引物和MGB探针,构建重组质粒作为阳性标准品,优化引物、探针浓度及Rox参比染料用量、退火温度等反应条件,建立针对mcr-1基因的Taq Man-MGB荧光定量PCR检测方法,并通过特异性、敏感性、重复性试验及临床应用验证其实用性。【结果】Taq Man-MGB荧光定量PCR最佳反应体系20.00μL:Premix Ex Taq^(TM)10.00μL,Rox参比染料(50×)0.25μL,引物MCR-1F/MCR-1R(10μmol/L)各0.50μL,MCR-1-P探针(10μmol/L)0.50μL,重组质粒pMCR-1(模板)2.00μL,灭菌双蒸水6.25μL。扩增程序:95℃预变性20 s;95℃10 s,60℃20 s,进行40个循环。该检测方法能特异性扩增出mcr-1基因,其检测敏感性为2.85拷贝/μL,是常规PCR的100倍,组内和组间重复性试验的变异系数为0.37%~1.18%,均小于1.20%。采用建立的Taq Man-MGB荧光定量PCR对82株广西鸡源致病性沙门氏菌分离株进行检测,结果未发现有携带mcr-1基因的菌株。【结论】针对mcr-1基因建立的Taq Man-MGB荧光定量PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可用于临床筛查mcr-1基因,为监控mcr-1基因携带细菌提供技术支持。 展开更多
关键词 黏菌素 mcr-1基因 TAQMAN-MGB探针 荧光定量pcr
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Taqman-MGB双重探针PCR技术检测军团菌 被引量:5
15
作者 朱水荣 金大智 +3 位作者 张政 王志刚 卢亦愚 徐宝祥 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期174-178,共5页
目的建立同时检测军团菌属和嗜肺军团菌的双重荧光定量PCR方法。方法利用军团菌16SrDNA和rnip基因的特异性序列设计引物和MGB探针,两条探针5’端分别标记FAM和HEX,3’端标记MGB。优化了荧光定量PCR反应条件和反应体系,并对军团菌、... 目的建立同时检测军团菌属和嗜肺军团菌的双重荧光定量PCR方法。方法利用军团菌16SrDNA和rnip基因的特异性序列设计引物和MGB探针,两条探针5’端分别标记FAM和HEX,3’端标记MGB。优化了荧光定量PCR反应条件和反应体系,并对军团菌、嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其它细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果该方法所检测菌株中军团茵属结果均为16SrDNA阳性(LP12、LP13除外);嗜肺军团菌均为mip阳性,非嗜肺军团菌属除L.micdadei外均为阴性;而非军团菌菌株16SrDNA和mip检测结果均为阴性。检测灵敏度达10个拷贝/反应;重复性实验中,变异系数为0.2%~O.6%;从菌株核酸的提取至检测完成仅需2h左右。结论本文建立的TaqMan-MGB双重探针荧光定量PCR是一种定量检测军团菌的特异、快速、敏感的方法,可区分嗜肺与非嗜肺军团菌属,该方法的建立将有益于今后开展对外环境污染源进行初步卫生学调查与评估,以及应急临床标本的快速定量检测。 展开更多
关键词 军团菌 双重荧光定量pcr MGB探针 16S RDNA基因 MIP基因
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TaqMan MGB实时荧光PCR对转基因大豆定量检测的研究 被引量:8
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作者 黄东东 翁少萍 +2 位作者 吕玲 常迪 何建国 《中山大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期140-142,共3页
利用实时荧光定量PCR技术,根据转基因大豆(Roundup ReadyTM)的外源基因35S启动子序列设计引物和TaqMan MGB探针,对大豆粉中Roundup ReadyTM大豆含量进行了定量检测,根据这个检测体系建立了35S启动子Ct值与样品中转基因成分数量之间的标... 利用实时荧光定量PCR技术,根据转基因大豆(Roundup ReadyTM)的外源基因35S启动子序列设计引物和TaqMan MGB探针,对大豆粉中Roundup ReadyTM大豆含量进行了定量检测,根据这个检测体系建立了35S启动子Ct值与样品中转基因成分数量之间的标准曲线和线性回归方程(相关系数r2:0.9942)。本研究设计的方法还可以应用到多组分的食品、饲料等加工产品,检测转基因成分的含量,并可作为转基因食品常规PCR定性检测方法。 展开更多
关键词 转基因大豆 实时定量pcr TAQMAN MGB探针 基因 生物技术 食品技术
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鹦鹉热嗜性衣原体特异性TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量:6
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作者 冯悦 张忠华 +1 位作者 龚福明 柳陈坚 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第11期1041-1044,1058,共5页
目的建立一种特异、灵敏、重复性好的鹦鹉热嗜性衣原体的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法。方法利用鹦鹉热嗜性衣原体MOMP基因的特异保守序列设计引物和MGB探针,通过优化,获得最佳反应体系与反应条件,同时进行特异性、重复性、灵敏性评价... 目的建立一种特异、灵敏、重复性好的鹦鹉热嗜性衣原体的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法。方法利用鹦鹉热嗜性衣原体MOMP基因的特异保守序列设计引物和MGB探针,通过优化,获得最佳反应体系与反应条件,同时进行特异性、重复性、灵敏性评价与Spike-test实验进行临床应用性评价,利用该检测方法对禽鸟类粪便样品进行检测,并与常规PCR检测方法进行比较。结果该方法在0.01pg^100pg范围内线性相关系数为0.999,扩增效率为97.7%;对鹦鹉热嗜性衣原体菌株检测结果均呈现阳性,而非鹦鹉热嗜性衣原体菌株及其它衣原体菌株为阴性;重复性试验中,变异系数为0.317%~0.563%;检测灵敏性为0.01pg;Spike-test试验中最低检出量为25个EB;该方法对禽鸟类粪便样品的检出率为14.3%(40/282),高于常规PCR检测法的7.4%(21/282)。结论本文所建立的Taqman-MGB荧光定量PCR检测法是一种灵敏、高效、稳定,可在嗜性衣原体属中准确检测鹦鹉热嗜性衣原体的方法,该方法的建立更有意于今后对禽鸟类实施鹦鹉热的临床诊断与分子流行病学研究。 展开更多
关键词 鹦鹉热嗜性衣原体 荧光定量pcr MGB探针 MOMP基因
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TaqMan荧光定量RT-PCR检测犬瘟热病毒方法的建立与初步应用 被引量:3
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作者 吕品 胡传伟 +2 位作者 谢之景 杨笃宝 任月 《兽类学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期293-297,共5页
To establish a TaqMan-based real-time RT-PCR method for detection of canine distemper virus,the pair of primers and the TaqMan-based probe were designed according to the M protein genes of canine distemper virus strai... To establish a TaqMan-based real-time RT-PCR method for detection of canine distemper virus,the pair of primers and the TaqMan-based probe were designed according to the M protein genes of canine distemper virus strains.The reactive conditions were optimized to improve the sensitivity and specificity of the method.The specificity and sensitivity of the method were high.Canine distemper virus in the thirty-eight samples had been tested by the TaqMan-based real-time RT-PCR,the common RT-PCR and electron microscopy.The sensitivity of the TaqMan-based real-time RT-PCR was higher than the common RT-PCR and electron microscopy.This suggests that the method may be used in clinical diagnosis,epizootic study and laboratory research. 展开更多
关键词 荧光定量RT-pcr TAQMAN探针 犬瘟热病毒 M基因
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超级细菌bla_(NDM-1)基因TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立 被引量:5
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作者 施开创 李凤梅 +3 位作者 张步娴 黎宗强 莫胜兰 许心婷 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期952-956,共5页
为建立快速检测超级细菌编码新德里金属β-内酰胺酶1(NDM-1)的bla_(NDM-1)基因的方法,本研究针根据bla_(NDM-1)及其变异体的基因序列设计一对特异性引物和一条MGB探针,以构建的含有bla_(NDM-1)基因片段的重组质粒作为阳性标准品,经条件... 为建立快速检测超级细菌编码新德里金属β-内酰胺酶1(NDM-1)的bla_(NDM-1)基因的方法,本研究针根据bla_(NDM-1)及其变异体的基因序列设计一对特异性引物和一条MGB探针,以构建的含有bla_(NDM-1)基因片段的重组质粒作为阳性标准品,经条件优化,建立了检测bla_(NDM-1)基因的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。结果显示该方法可以特异性扩增bla_(NDM-1)基因重组质粒标准品,而对鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的标准菌株扩增均为阴性;检出下限为2.59拷贝/μL,比常规PCR敏感性高100倍;组内及组间重复性试验的变异系数均小于1.5%。利用所建立的方法对34株鸡源致病性沙门氏菌分离株进行检测,结果均未检测到目的片段,表明所有分离株均未携带bla_(NDM-1)基因。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于监测携带bla_(NDM-1)基因及其变异体的超级细菌。 展开更多
关键词 TaqMan—MGB探针 荧光定量pcr blaNDM-1基因 超级细菌 检测方法
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TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测土拉弗朗西斯菌 被引量:3
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作者 赵素慧 王春晖 +6 位作者 周莹 韦耀 韩桂圆 钮红岺 赵卫 张其威 万成松 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期602-606,共5页
目的建立TaqMan探针实时荧光定量PCR方法(QF-PCR),快速检测土拉弗朗西斯菌。方法针对土拉弗朗西斯菌的外膜蛋白fopA基因,利用Primer 5.0设计引物及TaqMan探针,人工合成fopA基因保守片段,克隆到载体作为阳性标准品,进行荧光定量检测,制... 目的建立TaqMan探针实时荧光定量PCR方法(QF-PCR),快速检测土拉弗朗西斯菌。方法针对土拉弗朗西斯菌的外膜蛋白fopA基因,利用Primer 5.0设计引物及TaqMan探针,人工合成fopA基因保守片段,克隆到载体作为阳性标准品,进行荧光定量检测,制作定量标准曲线,并以合成fopA基因为模板,PF、PR为引物,研究其灵敏度、特异性和准确性。结果构建了含fopA基因的重组质粒,以不同浓度的重组质粒制作标准曲线,在103~107拷贝数之间有较好的线性关系。灵敏度试验表明,该方法可检测到30.6个拷贝数的重组质粒,比普通PCR灵敏度高;特异性试验表明,能选择性检测土拉弗朗西斯菌,而与其他病原菌无交叉反应,与普通菌落PCR结果一致;重复性试验表明,拷贝数为3.06×106样品5次平行试验,标准差为0.201,变异系数为0.88%。结论本研究建立了TaqMan探针QF-PCR快速检测技术,具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可用于快速、实时、定量检测土拉弗朗西斯菌,为快速检测生物战剂级微生物建立了一种人工合成特异基因TaqMan探针实时荧光定量PCR新方法。 展开更多
关键词 土拉弗朗西斯菌 TAQMAN探针 fopA基因 荧光定量pcr
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