NKG2D真核表达载体的构建及其对YT细胞生物学功能的影响

目的建立NK细胞受体NKG2D真核表达载体,通过转染NK细胞系YT,初步探讨NKG2D分子对YT细胞系杀伤功能的增强作用。方法用RT-PCR方法从NK-92细胞中调取NKG2D基因片段,克隆到pGEM-T Easy载体并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ消化pGEM-T Easy/NKG2D重组质粒,分离NKG2D片段,并插入真核表达质粒pEGFP-N1的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pEGFP-N1/NKG2D。然后经脂质体介导转染CHO细胞和YT细胞。应用荧光显微镜观测、Western blot方法和免疫组化染色对转染细胞内pEGFP-N1/NKG2D的表达进行鉴定,MTT方法观察YT细胞对肿瘤细胞的杀伤功能。结果RT-PCR扩增获得650bp基因片段,经DNA序列分析证明所获得的DNA序列与文献报道的NKG2D序列一致。转染的CHO细胞在荧光显微镜下发出强绿色荧光,Western blot分析显示重组蛋白能特异地与抗人NKG2D单克隆抗体结合;免疫组化检测显示,转染的CHO中有棕色颗粒,证明所构建的NKG2D真核表达载体可以在细胞中表达;转染NKG2D真核表达载体的YT细胞对乳腺癌细胞具有更强的杀伤效果。结论所获得的表达NKG2D分子的真核表达载体,通过转染YT细胞,初步鉴定所表达NKG2D分子具有生物学功能,可以提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。