稳定表达GFP-LC3的RAW264.7细胞系的建立

目的:建立稳定表达GFP-LC3的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系。方法:构建pcDNA3.1-GFP-LC3真核表达载体,应用转染技术将该质粒导入RAW264.7细胞,用G418筛选稳定表达的细胞系。真核细胞中GFP-LC3的表达分别用荧光显微镜与Western blot方法检测,并利用该稳定表达细胞系观察内质网应激时细胞发生自噬的情况。结果:成功获得2株转染并经G418反复筛选的RAW264.7细胞系,在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光的表达率在95%以上,Western blot结果证实了GFP-LC3融合蛋白的表达。激光共聚焦显微镜和Western blot均证明内质网应激可以诱导自噬的发生。结论:用pcDNA3.1-GFP-LC3转染的RAW264.7细胞经G418筛选,可成功建立GFP-LC3稳定表达系,从而为后续功能实验提供有用的细胞研究模型。

自噬相关基因LC3和ATG5在胃癌中的表达及临床意义

目的探讨自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和自噬相关基因-5(autophagy related gene-5,ATG5)在胃癌细胞发生发展不同阶段的表达情况并分析其临床意义。方法选取胃黏膜正常细胞、胃黏膜不典型增生细胞、胃癌细胞共58例,分别记为正常组(17例)、不典型组(19例)、胃癌组(22例),采用qRT-PCR、Western Blot、免疫组织化学法检测每组中自噬相关基因LC3和ATG5的mRNA及蛋白表达水平,应用SPSS 23.0软件分析正常组、不典型组、胃癌组3组间LC3和ATG5的mRNA及蛋白表达情况,并分析LC3和ATG5蛋白表达的相关性以及LC3和ATG5蛋白表达与胃癌患者临床病理学参数的关系。结果正常组、不典型组、胃癌组中LC3和ATG5 mRNA及蛋白表达水平逐渐升高,各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。LC3蛋白表达情况与性别、年龄、浸润深度、分化程度及淋巴结状态均不存在相关性。ATG5蛋白表达情况与浸润深度、分化程度及淋巴结状态均有相关性。LC3和ATG5蛋白在3组中均呈正相关(P<0.05)。结论细胞自噬可促进胃癌的发生发展,其机制可能与LC3、ATG5过度表达有关。LC3、ATG5在促进胃癌的发生发展中起相互协同的作用。

Bcl-2和LC3对膀胱癌发生发展及预后的相关性分析

目的研究膀胱尿路上皮癌细胞中Bcl-2与自噬相关基因LC3表达及生物学行为,并探讨其对膀胱癌预后的影响。方法Bcl-2 siRNA质粒转染人膀胱移行细胞癌(T24)细胞,蛋白质印迹法和逆转录聚合酶链式反应检测Bcl-2和LC-3的表达,并研究Bcl-2敲降对T24细胞体外生长和凋亡的影响。在癌组织病理标本中检测Bcl-2和LC3的表达情况,进行预后分析。结果Bcl-2 siRNA重组质粒成功转染T24细胞,Bcl-2 mRNA表达下调约80%,Bcl-2蛋白表达下调约70%,LC3的mRNA和蛋白水平下调了约40%。pGenesil-1 Bcl-2 siRNA组Bcl-2和LC3蛋白表达低于NC组及空质粒组,差异有统计学意义(P<0.05)。T24细胞活力降低为(66.8±5.8)%,细胞凋亡率为56.68%。pGenesil-1 Bcl-2 siRNA组细胞活力高于空质粒组及NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。正常膀胱组织和膀胱癌中LC3表达的阳性率表达比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Bcl-2蛋白在正常膀胱组织及膀胱尿路上皮癌中的表达的阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。不同分级、分期的膀胱尿路上皮癌样本中LC3蛋白的表达比较,差异有统计学意义(P<0.05)。有无淋巴结转移的膀胱尿路上皮癌样本中Bcl-2蛋白的表达比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论Bcl-2基因的下调会降低膀胱癌细胞LC3的表达水平,抑制细胞生长,促进其凋亡。Bcl-2与LC3结合有助于判断膀胱尿路上皮癌的预后。

甲状腺癌组织自噬相关基因Beclin-1和LC3的蛋白表达及其临床病理学意义

目的探讨甲状腺癌中自噬相关基因Beclin-1和LC3的表达及意义。方法收集2013-2016年威海市市立医院甲状腺外科手术切除的甲状腺癌63例标本,以距肿瘤边缘5cm以上的组织定义为配对癌旁组织,并收集同期住院的甲状腺腺瘤(42例)和结节性甲状腺肿组织标本(31例)。采用免疫组织化学SP法检测上述标本中Beclin-1和LC3的表达情况及两者之间的相关性。结果各组织Beclin-1蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05)。甲状腺癌中Beclin-1的阳性表达率(39.68%,25/63)明显低于甲状腺腺瘤(69.05%,29/42)、结节性甲状腺肿(83.87%,26/31)和癌旁正常组织中(85.71%,54/63)的阳性表达率(P<0.05)。LC3蛋白在甲状腺癌的阳性表达率为25.40%(16/63),在甲状腺腺瘤、结节性甲状腺肿、癌旁正常组织中的阳性表达率分别为40.48%(17/42)、38.72%(12/31)、42.86%(27/63)。在甲状腺癌中LC3表达低于以上正常的3种组织。4者比较LC3的表达差异有统计学意义(P<0.05)。Beclin-1蛋白的表达与颈部淋巴结转移有关(χ~2=8.433,P=0.000)。经Spearman相关性检验分析,在甲状腺癌中LC3与Beclin-1蛋白成正相关(r=0.272,P=0.031)。结论 Beclin-1、LC3在甲状腺癌中低表达,在甲状腺癌中Beclin-1与LC3的表达量呈正相关。

克氏原螯虾LC3基因克隆及组织特异性表达

为了研究克氏原螯虾LC3基因的序列及其生物信息学,分离并提取肝胰腺组织,并克隆了其LC3基因ORF全长序列。结果表明,克氏原螯虾LC3基因ORF序列片段为369 bp,编码122个氨基酸。结构分析显示,LC3基因存在2个结构域,证明了LC3基因在细胞自噬中存在多种功能。序列比对及系统进化树分析表明,克氏原螯虾与节肢动物进化关系最接近,其LC3基因序列具有节肢动物的典型特征,在进化过程中保守性较高。荧光定量PCR显示,克氏原螯虾LC3基因在肝胰腺中表达水平最高,与肠道相比有显著差异(P<0.05),与心脏和肌肉无显著差异(P>0.05);心脏和肌肉中LC3基因的表达量次之,但与肠道相比差异显著(P<0.05);肠道中LC3表达量最低。该研究结果可为深入研究LC3基因表达与动物营养调控提供基础依据和参考。

头颈部鳞状细胞癌中Klotho基因表达及其甲基化水平与LC3和NSUN2基因表达的相关性

目的探究头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)中Klotho(KL)基因的表达及其启动子区域甲基化水平与自噬基因LC3和RNA甲基转移酶基因NSUN2之间的关系。方法从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Altas,TCGA)数据库中搜集有关HNSCC患者标准化的上四分位转录组测序(RNA-seq V2 RNA-seq by expectation maximization,RSEM)值和KL甲基化的β值(beta-value)信息,采用Kaplan-Meier生存曲线评估KL表达及其启动子区域甲基化与患者存活率之间的关系;采用Spearman相关检测分析KL的表达水平及其启动子区域甲基化水平与LC3和NSUN2表达之间的关系。结果在HNSCC患者当中,KL表达水平与患者的总生存期呈正相关,而KL启动子区域甲基化水平与总生存期间却有着相反的趋势。且KL高水平表达或其启动子区域低水平甲基化的HNSCC患者往往伴有LC3高表达和NSUN2低表达。结论在HNSCC患者中,KL表达水平及其启动子区域甲基化水平可作为提示患者预后的一种潜在的生物标志物,且其下游靶点LC3和NSUN2的表达也会受到KL表达的影响。

三七总皂苷对ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化斑块形成及自噬的影响

目的:探讨三七总皂苷对载脂蛋白E基因敲除ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)斑块形成的影响及其作用机制。方法:8只雄性C57BL/6J小鼠为对照组,32只ApoE^(-/-)小鼠随机分为模型组、三七总皂苷低剂量组(40 mg·kg^(-1))、三七总皂苷中剂量组(80 mg·kg^(-1))、三七总皂苷高剂量组(160 mg·kg^(-1)),每组各8只。对照组给予普通饲料喂养,其余各组采用高脂饲料喂养的同时进行药物干预,对照组、模型组给予等量生理盐水灌胃,每日1次,共干预8周,观察小鼠体质量和精神状态。全自动生化仪检测小鼠血清中总胆固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triacylglycerol,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)的水平;油红O染色观察主动脉斑块分布情况;HE染色观察小鼠主动脉病理变化;Western Blot检测小鼠主动脉中Beclin1蛋白表达水平;免疫荧光法检测LC3的表达水平;透射电镜观察小鼠主动脉自噬体形成情况。结果:与对照组比较,模型组小鼠体质量增加,血清TG、TC、LDL-C水平升高,主动脉内壁斑块增多,Beclin1、LC3蛋白表达水平升高,自噬体数量增多;与模型组比较,三七总皂苷可降低动脉粥样硬化小鼠体质量及血清中TG、TC、LDL-C水平,减少主动脉内壁斑块,降低Beclin1、LC3蛋白表达水平及自噬体数量,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:三七总皂苷可抑制ApoE^(-/-)小鼠AS斑块的形成,其作用机制可能与调控自噬水平相关。

抑癌基因SPRED2在肾透明细胞癌中的表达及意义

目的在肾透明细胞癌进展过程中,初步探讨抑癌基因SPRED2所起到的生理学作用。方法收集遵义医科大学附属医院泌尿外科近年接受手术的肾透明细胞癌患者的癌组织及癌旁组织标本,另取材于良性肾脏病变组织作为正常肾组织对照。采用免疫组织化学法及Western-blot,分别检测SPRED2及LC3蛋白在肾透明细胞癌组织、癌旁组织以及正常肾组织中的表达情况,并将各组织中两种蛋白的具体表达水平进行两两比较。结果通过免疫组化染色(n=10),初步确定SPRED2及LC3蛋白在组织中的表达定位于细胞膜和胞浆,以细胞膜为主。Western-blot结果显示(n=9),SPRED2在癌组织、癌旁组织及正常肾组织中的表达水平分别为(0.52±0.24)、(0.86±0.30)及(1.47±0.55)。SPRED2在癌组织中的表达含量显著低于癌旁组织(P<0.05),在癌旁组织中的表达含量明显低于正常肾组织(P<0.01),差异均有统计学意义。LC3在癌组织、癌旁组织及正常肾组织中的表达水平分别为(1.34±0.40)、(0.72±0.32)及(0.33±0.12)。LC3在正常肾组织中的表达含量明显低于癌旁组织(P<0.01),在癌旁组织中的表达含量明显低于癌组织(P<0.05),差异均有统计学意义。结论SPRED2在肾透明细胞癌组织中的表达含量显著降低,并低于癌旁组织及正常肾组织,其在肿瘤进程中可能发挥抑制作用。

自噬相关基因在肾透明细胞癌中的表达及其临床意义

目的本研究通过对肾透明细胞癌自噬相关基因蛋白水平的检测,分析其与临床病理资料的关系。方法 Western blot检测肾透明细胞癌中自噬相关基因LC3和Beclin1的蛋白表达量。结果 Western blot检测显示肾透明细胞癌中自噬相关基因LC3和Beclin1的蛋白表达水平均低于癌旁组织组(P<0.05);低分化组和中分化组LC3的蛋白表达水平比高分化组低(P<0.05);进展期和转移性肾癌组比局限性肾癌组LC3的蛋白表达水平低(P<0.05)。结论自噬在肾透明细胞癌中的低表达水平可能与肾透明细胞癌的发生、发展及转移有关。

苦参碱诱导肝癌HepG2细胞自噬的作用与机制

目的探讨苦参碱对肝癌HepG2细胞自噬的作用,进一步研究苦参碱诱导HepG2细胞自噬的机制。方法将0.0(对照组)、0.4、0.8、1.6g·L^(-1)苦参碱及0.4g·L~(^(-1))苦参碱+10mmol·L^(-1)自噬特异抑制剂(3-MA)分别作用于肝癌HepG2细胞,构建体外模型。采用免疫印迹法(Western blotting)检测自噬基因LC3-Ⅱ的表达,实时荧光定量PCR(Realtime-PCR)检测自噬基因WIPI1的表达,Annexin V FITC-PI流式细胞术检测HepG2细胞凋亡率,电镜观察HepG2细胞自噬体变化与凋亡情况。结果 0.4、0.8、1.6g·L^(-1)苦参碱作用的HepG2细胞LC3-Ⅱ表达相比对照组均显著增加(P<0.05),其中0.4g·L^(-1)苦参碱作用的HepG2细胞LC3-Ⅱ表达水平最高;0.4g·L^(-1)苦参碱作用的HepG2细胞自噬体、WIPI1mRNA表达水平较对照组明显增加(P<0.05)。0.4g·L^(-1)苦参碱联合3-MA作用的HepG2细胞凋亡率较单纯0.4g·L^(-1)苦参碱作用的凋亡率显著增加(P<0.05)。结论苦参碱诱导HepG2自噬且减少细胞凋亡,与WIPI1的表达相关。自噬抑制剂可抑制苦参碱诱导的自噬,促进肝癌细胞凋亡,二者联合可成为临床治疗肝癌的新措施。

心肌细胞缺氧中番茄红素对自噬的作用

目的探讨在心肌缺氧损伤中,番茄红素的作用及对自噬的影响。方法原代培养乳鼠心肌细胞予以无血清、无糖培养及缺氧干预,模拟心肌缺血,用番茄红素干预。在光学显微镜下观察缺氧后心肌细胞的形态;利用CCK-8法测量心肌细胞的存活率;及免疫印迹方法检测自噬相关基因LC3蛋白表达。结果 1番茄红素提高了心肌缺氧时细胞的存活率。2番茄红素增加了LC3蛋白的表达。3自噬的阻断剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)削弱了番茄红素保护心肌细胞的作用。结论番茄红素可能通过激活自噬来提高心肌细胞抗缺血缺氧的能力。

自噬相关基因Beclin 1和微管相关蛋白轻链3在胃癌组织中的表达及临床意义

目的探究Beclin-1及LC3蛋白在胃癌组织中的表达水平,并分析其临床病理意义。方法选取2015年3月—2016年3月我院收治的患者146例,收集其胃癌组织标本及癌旁组织标本,并采集146例健康黏膜组织作为对照组,利用SP方法检测Beclin-1和LC3的表达,并分析其表达与临床病理特征的关系。结果 Beclin-1及LC3在健康黏膜组织的表达最高,在胃癌组织中的表达最低,此外,上述两组蛋白在不同的性别、年龄及发病部位无明显差异,但在T3~T4分期、高、中分化程度及有淋巴结转移的胃癌组织中表达率显著降低。结论胃癌组织中的Beclin-1及LC3蛋白的表达量显著低于正常组织及癌旁组织,提示与胃癌的发生及发展密切相关,本研究为胃癌的诊断、预防及治疗提供了新的思路。

携带Flag标签的人自噬相关蛋白4B的真核表达及功能鉴定

目的:构建携带Flag标签的人自噬相关基因4B(ATG4B)的真核表达质粒,获得Flag-ATG4B融合蛋白,并检测其与LC3的相互作用。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增获得ATG4B序列,并将其插入pc DNA3.0-Flag载体构建成重组质粒,转染HEK293T细胞后用Western印迹检测融合蛋白的表达,用免疫共沉淀检测ATG4B与LC3的相互作用。结果:菌液PCR和重组质粒的双酶切结果及测序均表明重组质粒构建成功,Western印迹表明融合蛋白在HEK293T细胞中获得表达,免疫共沉淀结果表明表达的ATG4B能与LC3结合。结论:构建了pc DNA3.0-Flag-ATG4B真核表达质粒,表达的ATG4B蛋白对LC3的切割至关重要。

自噬在血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大中的作用

【目的】探讨自噬在血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导心肌细胞肥大中的作用。【方法】原代培养的乳鼠心肌细胞,采用AngⅡ干预建立心肌肥大的模型;在光学显微镜下观察心肌细胞的形态,采用Real time PCR技术检测心肌细胞肥大标志物心房利钠多肽(ANP)的表达、Western blot法检测LC3蛋白的表达。【结果】AngⅡ可抑制自噬相关基因LC3蛋白的表达。自噬阻断剂3-甲基腺嘌呤(3MA)会促进AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。【结论】AngⅡ可能通过抑制自噬来诱导心肌细胞肥大。

新风胶囊通过调节自噬相关蛋白的表达改善佐剂关节炎大鼠的肺功能

目的观察新风胶囊(XFC)对佐剂关节炎(AA)大鼠滑膜、肺组织自噬相关基因(ATG)、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)和beclin 1的影响。方法将大鼠随机分为正常对照(NC)组、模型对照(MC)组、来氟米特(LEF)组、XFC组,每组10只,除NC组外均将Freund完全佐剂(0.1 m L/只)注射于每只大鼠右后足跖皮内以致炎,第10天在尾根部注射Freund完全佐剂0.05 m L加强免疫,复制AA模型。致炎后第13天给药。NC组、MC组给予生理盐水灌胃,每天1次;LEF、XFC组给予相应药物灌胃,每天1次,连续给药30 d。观察大鼠足跖肿胀度、关节炎指数、肺功能,ELISA检测血清细胞因子B细胞刺激因子(BAFF)、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-4、IL-10表达,透射电镜观察滑膜、肺组织自噬小体,反转录PCR检测大鼠滑膜、肺组织ATG5、ATG7、ATG12 mRNA,Western blot法检测大鼠滑膜、肺组织LC3-Ⅱ、beclin 1的蛋白表达。结果 XFC组大鼠肺功能参数、血清IL-4、IL-10表达升高;滑膜、肺组织自噬体及自噬溶酶体较MC组增加;血清IL-1β、BAFF表达及滑膜组织ATG7、ATG12 mRNA降低,肺组织ATG5、ATG7 mRNA降低,ATG12 mRNA升高;滑膜组织、肺组织LC3-Ⅱ、beclin 1升高。结论 XFC通过调节AA大鼠滑膜、肺组织细胞自噬,改善肺功能。

UCH-L1对急性低压低氧小鼠海马中α-突触核蛋白表达水平的调控作用

目的探讨急性低压低氧条件下UCH-L1基因敲除对小鼠海马中α-突触核蛋白(α-Syn)表达水平的影响及其机制,为治疗α-Syn蛋白相关的神经系统疾病提供依据。方法采用UCH-L1基因杂合子(UCH-L1^(+/-))小鼠雌雄交配的方式获得UCH-L1基因敲除纯合子(UCHL1^(-/-))小鼠和野生型小鼠(UCH-L1^(+/+)),PCR法鉴定小鼠的基因型。将UCH-L1^(+/+)小鼠和UCH-L1^(-/-)小鼠放入低压氧舱模拟海拔8000 m高度,持续低氧8 h,建立急性低压低氧模型。采用Western Blot法检测小鼠海马中UCH-L1、α-突触核蛋白及LC3蛋白表达水平的变化,观察UCH-L1基因敲除对α-突触核蛋白表达水平及其相关细胞自噬降解通路的影响。结果与对照组(0.702±0.121)相比,急性低压低氧可诱导野生型小鼠海马中α-突触核蛋白表达水平(1.310±0.096)显著升高(P<0.05),LC3Ⅱ/Ⅰ的比值轻度升高,而对UCH-L1蛋白的表达水平没有影响。当敲除UCH-L1基因的小鼠经急性低压低氧处理后,小鼠海马中α-突触核蛋白表达水平(0.952±0.093)明显低于野生型对照组(1.490±0.074)(P<0.05),同时LC3Ⅱ/Ⅰ的比值也显著升高(P<0.05)。结论UCH-L1基因敲除降低了急性低压低氧诱导的α-突触核蛋白表达水平升高,其机制之一可能与小鼠在急性低压低氧时因敲除UCH-L1基因而进一步促进细胞自噬通路的活化有关。

电针预处理内关穴对心肌缺血再灌注大鼠自噬调控基因和自噬微管相关蛋白轻链3表达的影响

目的:基于不同时间点对比电针预处理内关穴对心肌缺血再灌注(MIRI)模型大鼠自噬基因的不同表达影响,探讨电针预处理的最优时间点。方法:48只SD大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、内关组,每组12只。根据不同时间点按3、7 d分时间点观察,每组6只。采用大鼠冠状动脉左前降支穿线结扎的手段创建心肌缺血再灌注损伤模型。HE染色法检测心肌细胞病理形态学变化,RT-PCR法、Western blotting法检测自噬相关基因在心肌细胞中的表达。结果:第3天模型组心肌损伤程度高于空白组、假手术组,模型组自噬调控基因(Beclin-1)、自噬微管相关蛋白轻链3(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)蛋白表达高于空白组、假手术组,差异有统计学意义(均P<0.01)。第3天内关组心肌细胞损伤程度低于模型组,内关组自噬相关基因表达量低于模型组,差异有统计学意义(均P<0.05)。第7天空白组、模型组均存在心肌组织细胞紊乱、结构模糊、自噬泡存在等表现;模型组自噬相关蛋白表达量明显升高。第7天内关组自噬相关蛋白表达量低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05),且心肌损伤情况较第3天改善。第7天模型组、内关组的心肌损害程度均较第3天减轻,细胞器损坏程度也有所改善。第7天模型组、内关组的蛋白表达低于第3天,差异有统计学意义(均P<0.05)。结论:电针预处理内关穴对MIRI模型大鼠的保护机制可能与自噬的相关调节有关,对比不同时间效应差异,第7天效果更佳。

ULK1基因调节氧糖剥夺所致的SH-SY5Y细胞自噬性死亡

目的探讨ULK1(unc-51-like kinase 1)基因调控的自噬过程在体外氧糖剥夺(Oxygen-glucose Deprivation,OGD)模型诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞死亡中的潜在作用机制。方法选取对数期生长的SH-SY5Y细胞,应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3MA),将细胞分为正常组和OGD组,正常组细胞分为正常对照组(不需进行预处理)和正常实验组(需进行3MA预处理),OGD组细胞分为OGD对照组(需进行OGD处理)和OGD实验组(需进行3MA预处理和OGD处理)。使用MTT检测细胞存活率。Western blotting检测各组细胞中自噬相关蛋白的表达水平。使用小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)沉默ULK1基因后,将SH-SY5Y细胞分为正常组和OGD组,正常组分为空转组、scrambled组(与ULK1基因有相同序列,但无明显同源性)、ULK1 SiRNA组,OGD组细胞分组为OGD空转组、OGD的scrambled组、OGD的ULK1 SiRNA组。使用MTT检测细胞存活率;Western blotting检测各组细胞中自噬相关蛋白的表达水平。应用慢病毒(stubRFP-sensGFP-LC3 Lentivirus)后,按OGD处理时间不同将细胞分为0 h、6 h、12 h、24 h 4组,荧光显微镜观察各组细胞中LC3红绿荧光蛋白数量变化。结果与正常组对照组相比,OGD对照组诱导的SH-SY5Y细胞生存率明显下降(P<0.01或P<0.05),SH-SY5Y细胞中LC3、Beclin-1、P-ULK1蛋白水平升高(P<0.01),P62蛋白水平下降(P<0.01),ULK1蛋白水平未见明显变化(P<0.01)。与OGD对照组相比,应用3MA和siRNA ULK1的OGD实验组细胞生存率显著升高(P<0.01),在应用3MA和siRNA ULK1细胞中Beclin-1、LC3、P-ULK1蛋白水平显著降低(P<0.01),P62蛋白水平升高(P<0.01),而ULK1蛋白在应用3MA后未见明显变化在应用siRNA ULK1后蛋白水平显著降低(P<0.01)。荧光显微镜观察显示:在转染慢病毒的SH-SY5Y细胞中,在OGD作用时间为0 h、6 h、12 h中,LC3红色荧光蛋白与LC3绿色荧光蛋白数量上无统计学差异(P<0.05或P<0.01),而在OGD处理24 h时,LC3绿色荧光蛋白与LC3红色荧光蛋白相比显著减少(P<0.05)。结论沉默ULK1基因可能通过抑制OGD诱导的SH-SY5Y细胞自噬进而阻止细胞的自噬性死亡过程。

猕猴溶组织内阿米巴凝集素hgl基因LC3段的克隆及原核表达

为了研究动物溶组织内阿米巴基因工程疫苗,以川西猕猴溶组织内阿米巴分离株中提取的总基因组DNA为模板,扩增了hgl基因抗原区LC3段,将其重组于原核表达载体pET-32b(+)中,构建了pET-32b(+)-hglLC3表达载体,转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达融合蛋白,获得了1200bp的hgl基因LC3编码区片段;SDS-PAGE分析结果显示,重组表达质粒产生了大小为66ku的目的条带,与预期的结果一致;Western-blot分析结果显示,重组蛋白与兔超免疫血清呈阳性反应,表明,该抗原可作为动物溶组织内阿米巴疫苗的候选抗原。

缺氧缺血新生大鼠神经元自噬基因表达节律及调控机制

目的通过新生大鼠缺氧缺血脑损伤后神经元自噬基因和节律基因的表达,探讨缺氧缺血引起神经损伤的新机制。方法将12只Sprague-Dawley大鼠随机分为缺氧缺血组和假手术组,每组6只。采用结扎并切断大鼠右侧颈总动脉并给予低氧处理的方法建立体内缺氧缺血脑损伤模型。Western blot检测两组大鼠大脑皮层和海马组织节律蛋白Clock表达情况。体外培养大鼠神经元细胞,随机分为氧糖剥夺(OGD)组和对照组,OGD组加入无糖无血清DMEM培养基模拟细胞缺血状态,并给予低氧处理建立体外缺氧缺血脑损伤模型。采用Western blot检测两组不同时间点自噬相关蛋白Beclin1和LC3,以及节律基因Clock蛋白表达情况。应用si RNA技术抑制神经元Clock蛋白表达后,检测Beclin1和LC3的表达变化。结果体外培养神经元Beclin1和LC3Ⅱ的表达呈现节律性波动;OGD处理后,体外培养神经元Beclin1和LC3Ⅱ的表达随着时间的延长逐渐升高,不再呈现节律性波动;与假手术组相比,缺氧缺血引起大鼠皮层和海马组织Clock表达降低(P<0.05);体外培养神经元经OGD处理后,Clock表达也较对照组显著降低(P<0.05);与阴性对照组相比,抑制神经元节律基因Clock表达后,自噬相关蛋白Beclin1和LC3Ⅱ的表达均显著下降(P<0.05)。结论缺氧缺血引起神经元Beclin1和LC3Ⅱ表达节律紊乱,其机制可能与Clock参与调控Beclin1和LC3Ⅱ的表达有关。