基因芯片技术检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药水平和katG、inhA、oxyR-ahpC以及rpoB基因突变位置的关联性分析

结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis,MTB）是一种能够引起结核病的病原菌,除了能够引起常见的肺结核外,还能够侵犯全身多个器官引起相应结核病。肺结核病是由结核分枝杆菌引起的呼吸系统传染病,人感染结核分枝杆菌后是否发病与免疫功能密切相关。目前结核病的诊断和治疗面临着巨大挑战,尤其是难治性结核病及耐药结核病的诊断及有效治疗问题。

聚合酶链反应-单链构象多态性技术检测耐多药结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL突变的研究

目的 应用PCR SSCP技术快速检测耐INH ,RFP ,SM结核分支杆菌分离株KatG、rpoB、rpsL基因突变 ,评价其在检测结核分支杆菌耐药性方面的价值。方法 32株耐INH、RFP、SM结核分支杆菌临床分离株及 2 5株结核分支杆菌敏感分离株用PCR SSCP方法分别检测 ,rpoB、KatG、rpsL基因突变。结果 32株耐多药结核分支杆菌分离株中 ,rpoB、KatG、rpsLPCR扩增产物PCR SSCP分别有 2 8株 (87.5 % )rpoB基因 ,19株 (5 9.3% )KatG基因和 2 3株 (71.9% )rpsL基因电泳条带与结核分支杆菌标准株H3 7Rv电泳条带相比有明显差异 ,而 2 5株结核分支杆菌敏感株的PCR SSCP条带与结核分支杆菌H3 7Rv相似 ,特异性为 10 0 %。结论 PCR SSCP方法敏感、特异 ,可快速检测结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL耐药基因突变 。

吉林省耐多药结核分枝杆菌rpoB及katG基因突变特征分析

目的分析吉林省耐多药结核分枝杆菌临床分离株rpoB、katG基因突变特点,为建立本省快速耐多药检测方法提供参考。方法对吉林省耐多药结核分枝杆菌菌株扩增rpoB、katG基因测序后比对分析。结果耐多药结核分枝杆菌rpoB、katG基因的突变率分别为83.53%和70.6%,突变类型包括点突变、联合突变和缺失。在rpoB基因中,82.30%突变发生在RRDR区域,最常见突变位点为rpoB 531、rpoB 526、rpoB 516。KatG基因突变率为70.6%,最常见突变位点为katG315,占所有突变的68.55%。结论吉林省耐多药结核分枝杆菌最常见突变位点为rpoB531、rpoB 526、rpoB 516和katG 315。

PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG,ahpC基因突变的研究

目的应用PCR -SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分支杆菌rpoB ,katG及ahpC基因突变 ,评价此方法用于结核分支杆菌利福平 (RFP)及异烟肼 (INH)耐药性试验的意义。方法以结核分支杆菌H3 7Rv为对照 ,30例耐RFP(单耐或多耐 )、2 1例耐INH(单耐和多耐 )的结核分支杆菌临床分离株及 10例敏感菌株 ;39例菌阳肺结核患者及 30例非结核性肺部疾病患者痰标本 ,采用PCR SS CP技术检测痰标本和菌株中的结核杆菌rpoB ,katG ,ahpC基因突变 ,并与药敏试验对照。结果PCR -SSCP检测痰标本中结核分支杆菌rpoB ,katG及ahpC基因突变的阳性率分别为 79% (31/ 39)、46 % (18/39)及 5 % (2 / 39)。结论PCR -SSCP可望成为直接检测临床痰标本中结核分支杆菌耐利福平及耐异烟肼的快速方法。

牛结核分支杆菌临床分离株rpsL,rpoB,KatG基因突变分析

采用噬菌体生物扩增法对本实验室分离鉴定的25株奶牛结核分支杆菌进行药敏分析,检测出14株耐链霉素、利福平、异烟肼菌株.用PCR扩增耐药株的rpsL基因片段(370 bp)、rpoB基因片段(213 bp)和KatG基因片段(458 bp),并对目的片段进行测序分析,其中5株耐链霉素菌株的rpsL基因在43位点发生突变,均由赖氨酸密码子(AAG)突变为精氨酸密码子(AGG);5株利福平耐药株的rpoB基因在531位点、526位点、511位点发生突变,其中有3株分离株的rpoB基因在531位点发生点突变,1株分离株的rpoB基因在526位点发生突变,1株分离株的rpoB基因在531位点和511位点发生了较为少见的联合突变;4株异烟肼耐药菌株,其中2株在315位点发生碱基突变,2株在463位点发生碱基突变.

牛结核分枝杆菌临床分离株rpoB、KatG基因突变分析

为了解牛结核分枝杆菌临床分离菌株对利福平(RFP)、异烟肼(INH)的分子耐药机制,本研究采用噬菌体生物扩增法对分离并鉴定的25株牛结核分枝杆菌进行药敏分析,筛选出9株耐利福平、异烟肼菌株,PCR扩增耐药株的rpoB基因片段(213bp)和KatG基因片段(458bp)并测序。通过对耐药基因的测序分析,5株利福平耐药株的rpoB基因在531位点(RNA聚合酶β-亚基编码基因起始密码子起,下同)、526位点、511位点发生突变,其中有3株rpoB基因531位点发生突变,1株rpoB基因526位点突变;1株rpoB基因在531位点和511位点发生了较为少见的联合突变;4株异烟肼耐药菌株,其中2株在315位点(KatG蛋白编码基因起始密码子起,下同)发生碱基突变,2株在463位点发生碱基突变。

南宁市某医院2014-2017年结核分枝杆菌rpoB、katG和inhA突变监测分析

目的了解某院结核分枝杆菌rpoB、katG和inhA突变特征及耐药性。方法采集经聚合酶链反应(PCR)鉴定为结核分枝杆菌的标本2 624份,采用线性探针(LipA)法检测rpoB、katG和inhA突变。结果 2 072份结果有效,rpoB、katG及inhA突变率依次是14.77%、12.11%及2.80%;相关利福平、异烟肼耐药率及耐多药率为14.77%、14.62%、9.60%。异烟肼耐药株中katG 315位突变占82.84%,rpoB突变株中突变频率居前的位点是531(63.40%)、H526Y或H526D(11.11%)、其他H526(8.50%),突变类型中"突变型探针出现并对应野生型探针缺失"占81.37%。结论该院结核分枝杆菌rpoB、katG和inhA突变特征与国内文献报道相近,相关利福平、异烟肼耐药率及耐多药率高于广西平均水平。

广西百色地区结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药基因特征

目的:分析百色地区结核分枝杆菌利福平耐药相关基因rpoB及异烟肼耐药相关基因KatG、inhA的突变特征。方法:收集128例结核病患者痰液标本,分离培养结核分枝杆菌并检测利福平及异烟肼耐药性,提取耐药菌株DNA,分析耐药相关基因突变特征。结果:耐利福平菌株rpo B基因突变率为75%(27/36),531位点突变率为59.3%(16/27)。耐异烟肼菌株KatG、inhA基因突变率为44.1%(15/34),其中315位点突变率为66.7%(10/15),出现2个新的突变位点279(4/15)和427(1/15)。inhA 5位点突变率为13.3%(2/15),inhA 16位点突变率为6.7%(2/15),3株为KatG和inhA联合突变。结论:百色地区耐多药结核分枝杆菌耐药性产生与rpoB、katG和inhA基因突变相关,检测本地区结核分枝杆菌耐多药相关基因突变为进一步研究耐药机制及耐药结核病的快速检测提供依据。

等位基因特异性PCR法快速检测结核分枝杆菌常见耐药突变基因

目的建立一套同步检测结核分枝杆菌(MTB)常见耐药突变基因的等位基因特异性PCR(AS-PCR)检测体系,以间接判断对利福平(RFP)与异烟肼(INH)的耐药性。方法用AS-PCR技术同步检测58株MTB临床分离株rpoB基因516位、526位和531位,katG基因315位及inhA基因-15位密码子突变,并与DNA测序结果进行比对。结果 AS-PCR法对RFP耐药株检出率为95.1%(39/41),其中rpoB基因531位、526位、516位点突变分别检出28株、10株、2株,包括531位与526位联合点突变1株;未检出突变的2株RFP耐药株经测序验证1株未发生突变、1株发生533位点突变;RFP敏感株均未检测到突变。AS-PCR法对INH耐药株检出率为86.5%(45/52),其中katG基因315位点突变43株、inhA基因-15位点突变2株,未检出突变的7株INH耐药株经测序验证未见突变;INH敏感株均未检测到突变。结论等位基因特异性PCR能够快速检测MTB常见突变基因,具有较高的敏感性与特异性,快速经济、操作简便。

中国部分地区结核分支杆菌耐利福平、异烟肼和链酶素耐药基因的检测

目的研究我国部分地区耐利福平(RFP)、异烟肼(INH)和链酶素(SM)结核分支杆菌临床分离株rpoB基因、KatGr、psL基因突变情况,评价其耐药分子机制。方法采用PCR和聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)对373株结核分支杆菌临床分离株(其中敏感株148株,耐RFPI、NH、SM株共225株)rpoB基因、KatG和rpsL基因进行检测。并对其中19株SSCP阴性的耐RFP株用双脱氧末端终止法进行测序分析。结果安徽省、北京市、上海市、河北省、河南省、辽宁省、吉林省结核分支杆菌耐RFP临床分离株rpoB基因突变率分别为90%、91%、90%、91%、90%、93%、91%;KatG基因突变率分别为69%、63%、71%、68%、67%、68%、65%,rpsL基因突变率71%、69%、74%、68%、70%、61%、76%,分别为经统计学处理不同地区间无显著性差异(χ2=0.46,P>0.05)。同时rpoB基因敏感株均无突变,特异性为100%;KatG基因有3株发生突变,特异性为98%。19株SSCP阴性耐药株中经测序6株在531位密码子TCG→TTG,1株526位密码子CAC→TAC,7株发生在516位密码子GAC→GTC,5株未改变。结论我国不同地区耐利福平、异烟肼和链霉素的rpoB、KatGr、psL耐药基因突变率大致相同,rpoB基因、KatG和rpsL基因突变分别是耐RFP、INH和SM结核分支杆菌耐药性产生的主要分子机制,PCR-SSCP可快速检测结核分支杆菌RFPI、NH和SM耐药性。

PCR-SSCP方法用于痰标本中结核分支杆菌耐药基因的检测

目的探讨采用直接检测结核病人痰标本中rpoB基因和KatG基因突变。评价该方法检测结核分支杆菌对利福平(RFP)和异烟肼(INH)耐药性。方法用PCR-SSCP技术分析,对35例耐INH(或含耐异烟肼)、63例耐RFP(或含耐RFP)的肺结核病人痰标本和20例非结核性肺部疾病组痰标本进行rpoB和KatG基因突变的检测。结果以结核分支杆菌H37RV为对照,63例耐RFP痰标本中57例PCR扩增阳性,其中46例SSCP图谱与H37Rv标准株有差异,rpoB突变率为65.2%。35例耐INH肺结核病人痰标本有20例扩增阳性,15例SSCP图谱与H37Rv标准株有差异,突变率为42.8%。20例非结核病人痰标本rpoB基因和KatG基因扩增均为阴性。结论PCR-SSCP技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的重要方法之一。

结核分枝杆菌katG、rpoB、rpsL耐药基因快速检测方法的建立

目的:建立一套应用multi-PCR-SSCP(multiple-Polymerase Chain Reaction-Single Strand Cinformation Poly-morphism)快速检测结核分枝杆菌耐药基因突变的方法,评价该方法的临床应用价值。方法:分别用常规PCR和multi-PCR-SSCP检测58株结核分枝杆菌临床分离株katG、rpoB、rpsL基因突变并与常规药敏试验检测结果进行对比。结果:经常规药敏试验检测,58株结核分枝杆菌临床分离株中有41株耐药,其中,耐异烟肼(INH)35株;耐利福平(RFP)31株;耐链霉素(SM)31株。单基因PCR-SSCP与multi-PCR-SSCP分析结果一致,检出katG、rpoB、rpsL基因的突变率分别为65.7%(23/35)、84%(26/31)、71%(22/31),17株药物敏感株中有1株rpoB基因SSCP电泳条带与结核杆菌标准株结果有差异。结论:multi-PCR-SSCP方法敏感、特异,可快速检测结核分枝杆菌katG、rpoB、rpsL耐药基因的突变,将该方法与药敏试验联合应用可互相弥补,成为临床指导用药的好方法。

武汉地区结核分枝杆菌异烟肼耐药性的基因分析

探讨武汉地区结核分枝杆菌临床分离株异烟肼耐药相关基因突变特征。通过PCR直接序列分析法对异烟肼耐药相关基因kat G基因及mab A-inhA启动子进行序列分析。20株异烟肼敏感株未检测到突变,49株耐药株中有40株(81.6%)存在突变,其中katG的S315突变率占主导优势,突变率为73.5%(36/49),mab A-inhA启动子区核苷酸置换率为8.2%(4/49),其中一株同时检测到了katG和mabA-inhA启动子区的突变。此外,还检测到了一种国内尚未报道的katG突变类型P232S(CCG→TCG)。研究证实kat G基因和mabA-inhA启动子的突变与异烟肼耐药相关,为进一步研究结核分枝杆菌异烟肼耐药性奠定了基础。

结核分支杆菌耐药分子机制的检测技术的研究

目的 :探讨结核分支杆菌对异烟肼、利福平耐药的分子机制 ,建立快速检测耐药分支杆菌基因型的分子生物学方法。方法 :采用聚合酶链反应 -单链构象多态性 (PCR -SSCP)同时检测结核分支杆菌敏感株和耐异烟肼、利福平耐药株的KatG基因、rpoB基因突变。结果 :78株结核分支杆菌临床分离株均未发现KatG、rpoB基因缺失。以结核分支杆菌H37RV为对照 ,3 6株药物敏感株的KatG、rpoB基因SSCP图谱均正常。 42株同时耐异烟肼和利福平的多耐药株中 ,KatG和rpoB基因突变率分别为 66.7% (2 8/4 2 ) ,90 .5 % (3 8/4 2 )。结论 :结核分支杆菌耐异烟肼、利福平耐药性的产生是由于KatG基因和rpoB基因突变所致。应用PCR -SSCP技术可同时快速检测结核分支杆菌异烟肼。

糖尿病合并肺结核患者耐多药结核分枝杆菌基因突变的检测

目的:探讨耐多药结核分枝杆菌临床分离株rPOB、KatG和rpsL基因突变在糖尿病合并肺结核患者耐药性检测中的应用价值。方法:采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术对41株自糖尿病合并肺结核患者痰液中培养分离的同时耐利福平(RFP)、异烟肼(INH)、链霉素(SM)的多耐药临床分离株和46株对RFP、INH、SM敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因突变状况。结果:46株药物敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因SSCP图谱正常,特异性为100%。PCR扩增产物SSCP分析结果显示:41株多耐药临床分离株中,36株rPOB基因图谱异常,26株KatG基因图谱异常,29株rpsL基因图谱异常,检测敏感性分别为rPOB(87.8%)、KatG(63.4%),rpsL(70.7%)。结论:结核分枝杆菌对RFP、INH、SM产生耐药性的机制主要是由于rPOB、KatG和rpsL基因突变所致。

尘肺结核患者Mycobacterium tuberculosis耐药基因突变研究

研究尘肺结核患者结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)耐药基因突变与耐药性的关系。在97例尘肺结核患者痰中检出MTB菌株28株,采用PCR-SSCP法检测katG、rpoB和rpsL基因突变,并与采用常规药敏试验(AST)法检测的耐药结果进行对比分析。采用PCR-SSCP法检测katG、rpoB和rpsL基因,突变率分别为42.86%(12/28)、42.86%(12/28)和32.14%(9/28),采用AST法检测INH、RFP和SM,耐药率分别为64.23%(18/28)、60.71%(17/28)和53.57%(15/28),两者之间差异均无显著性(P>0.05)。其中多耐药株20例(71.43%),包括耐三种药物12例(42.86%),耐两种药8例(28.57%),单耐药株6例(21.43%),敏感株2例,耐药率92.86%。PCR-SSCP法检出3个基因联合突变8株,与AST法符合率为66.67%(8/12);2个基因突变5株,符合率为62.50%(5/8);单基因突变2株,符合率为33.33%(2/6)。结果表明:PCR-SSCP技术适用于MTB katG、rpoB和rpsL耐药基因突变的筛选,对指导尘肺结核患者临床用药上具有重要意义。

耐异烟肼结核分枝杆菌及其katG、inhA基因的突变

目的探讨耐异烟肼结核分枝杆菌及其katG与inhA基因突变的特征,为临床选择抗结核药物治疗提供实验室参考。方法回顾性分析2015年1月1日-2017年1月1日在上海交通大学附属同仁医院海南分院的260例患者标本,对213例进行结核分枝杆菌分离培养,对47例进行博奥芯片法检测,再对213例培养所得菌株进行博奥芯片检测,对博奥芯片检测的47例痰标本进行结核分枝杆菌分离培养;对101株结核分杆菌进行katG与inhA基因检测。结果培养法和博奥芯片结核分枝杆菌检出率分别为36.6%(78/213)和48.9%(23/47);培养法和博奥芯片耐多药结核分枝杆菌检出率分别为41.0%(32/78)和47.8%(11/23);博奥芯片法和比例法耐异烟肼符合率98.7%(77/78);男性结核分枝杆菌阳性率45.9%高于女性阳性率29.2%;检测katG基因和inhA基因,3个基因区域都发生突变,突变发生率大小依次为katG315(AGC→ACC)密码子(32株,54.2%)、katG315(AGC→AAC)密码子(16株,27.1%)、inhA-15(C→T)(10株,16.9%)。24株(23.8%,24/101)对异烟肼无突变但对利福平发生突变;43株也同时耐利福平(42.6%,43/101)。突变频率较高的突变位点是315,突变频率为81.4%(48/59),1株(1.7%,1/59)为双位点联合突变且突变频率最低。结论结核分枝杆菌katG和inhA基因突变与耐INH相关,这为临床及时准确诊断、及早使用抗结核药物联合治疗提供了帮助。

应用PCR-荧光探针法快速检测耐多药结核分枝杆菌基因型

目的评价PCR-荧光探针法快速检测耐多药结核分枝杆菌基因型的临床应用价值。方法应用PCR-荧光探针法对142份涂阳痰液样本进行分子菌种鉴定,对鉴定为结核分枝杆菌复合群的标本进行katG、inhA、rpoB耐药基因突变位点检测,并与传统药敏试验结果比较。结果 142份涂阳痰样本中3份鉴定为非结核分枝杆菌,139份鉴定为结核分枝杆菌复合群;139株结核分枝杆菌中92株未检测出katG、inhA、rpoB基因耐药检测位点突变,其中传统药敏结果72株为HSRS、6株为HSRR、14株为HRRR;33株检测出katG和rpoB或inhA和rpoB两个基因耐药位点突变,传统药敏结果均为HRRR;11株检测出katG或inhA耐药基因位点突变,传统药敏结果均为HRRS;1株检测出rpoB耐药基因位点突变,传统药敏结果为HSRR,药敏试验符合率为84.17%;对部分样本行PCR产物直接测序(PCR-DS),结果显示,PCR-荧光探针和PCR-DS检测耐多药结核分枝杆菌基因型结果符合率为100.00%。结论 PCR-荧光探针法快速检测耐多药结核分枝杆菌基因型简便、快速,具有临床推广应用价值。

空洞型肺结核组织样本耐药菌及相关基因检测的临床研究

目的:比较分析空洞型肺结核组织样本与痰样本结核分枝杆菌培养的阳性率及检测的一致性,并基于rpoB基因及KatG基因突变检测在诊断耐多药结核分枝杆菌中的重要作用,探讨直接应用肺结核组织样本进行结核分枝杆菌耐药性检测的临床意义。方法:对肺结核实施肺部手术患者,在术前和术后分别进行痰及手术切除组织样本利用BacT ALERT 3D快速培养系统进行分枝杆菌培养,对培养阳性者进行菌种鉴定,对结核分枝杆菌分离株应用绝对浓度法进行异烟肼(H)、利福平(R)药物敏感性测定,比较分析二者的一致性;同时应用特异性引物对手术切除组织样本直接进行分枝杆菌rpoB、KatG基因扩增,并与其培养结果进行比较。结果:62例进入分析的病例中,术前痰培养阳性22例,阳性率35.5%(22/62),药敏试验耐药18例,耐异烟肼16例,耐利福平13例,二者均耐药12例,术中所取结核组织培养阳性34例,阳性率55%(34/62),耐药30例,耐H26例,耐R20例,二者均耐药17例,术中所取结核组织耐药基因检测与INH耐药性相关的KatG基因突变表现有22例,与RFP的耐药性相关的rpoB基因突变18例。二者同时有突变表现的16例。所有培养为结核敏感菌的组织检测中,无上述二基因突变表现。在相关的rpoB基因突变18例病例中有16例同时表现出KatG基因突(89%,16/18)。结论:厚壁空洞肺结核患者肺部手术切除组织样本病原学检测与痰样本间具有较好的一致性,且结核菌培养的阳性率明显高于普通痰培养。同时可直接应用组织样本进行结核分枝杆菌rpoB基因、KatG基因检测,可更加及时、准确地用于指导临床术后抗结核的药物治疗。

7例皮肤结核分离菌株药敏试验及利福平、异烟肼耐药基因突变情况分析

目的 探讨皮肤结核中结核分枝杆菌耐药及rpoB、katG耐药相关基因的突变情况.方法 从皮肤结核患者皮损或分泌物中分离、鉴定出7株结核分枝杆菌,采用比例法的间接法分别检测7株结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、链霉素和乙胺丁醇四种一线抗结核药物的耐药情况,并对利福平耐药基因rpoB和异烟肼耐药基因katG进行PCR扩增和DNA测序.结果 7株结核分枝杆菌中,6株对利福平、异烟肼、链霉素和乙胺丁醇均敏感,1株对利福平、异烟肼和乙胺丁醇同时耐药.7株结核分枝杆菌均扩增出rpoB和katG基因条带.DNA测序结果显示,临床耐多药菌株rpoB基因531位密码子由TCG突变为TTG,katG基因315位密码子由AGC突变为ACC;其余6株药物敏感株均未发现上述基因突变.结论 皮肤结核中已分离出耐多药菌株,耐多药菌株的形成可能与治疗不当相关.