应用酵母双杂交系统筛选新基因AngRem104相关蛋白

目的 :应用酵母双杂交系统筛选与新基因AngRem10 4相互作用的蛋白 ,为该基因的功能研究提供线索。方法 :构建AngRem10 4的真核表达载体AngRem10 4 pGBKT7/c myc,转化酵母菌AH10 9,Westernblot证实蛋白表达 ,进行毒性和自激活检验 ,与转化了成人肾脏cDNA文库的酵母菌Y187接合 ,筛选与AngRem10 4相互作用的蛋白。结果 :AngRem10 4蛋白能在酵母中正常表达 ,对酵母细胞无毒性 ,不存在自激活现象。筛选出的蛋白包括真核翻译延伸因子 1α1、糖皮质激素受体AF 1特异延伸因子、β2 微球蛋白、巴戴 -比德尔综合征 2蛋白及 4个与细胞代谢有关的蛋白。结论 :AngRem10 4可能影响细胞内某些转录因子活性和细胞代谢 ,并与某些免疫相关疾病和遗传病发病有关。酵母双杂交结果为AngRem10

AngRem104基因与绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建及在COS-1细胞中的表达定位

构建以绿色荧光蛋白 (Greenfluorescenceprotein ,GFP)为报告基因的重组表达质粒AngRem10 4 pEGFP N1,利用脂质体转染体外培养的COS 1细胞 ,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察AngRem10 4 EGFP融合蛋白在细胞中的分布和定位 ,用RT PCR和Westernblot方法验证其mRNA和蛋白的表达。结果表明在空载体pEGFP N1转染组中 ,COS 1细胞内绿色荧光呈弥散分布 ;重组质粒AngRem10 4 pEGFP N1转染组中 ,绿色荧光集中在细胞核中 ,随着表达量的增高 ,绿色荧光在细胞核中聚集成团块状、颗粒状。RT PCR的结果表明AngRem10 4在重组质粒转染组中的表达明显高于空载体和空白对照组。Westernblot的结果也确证了AngRem10 4 EGFP融合蛋白的表达。提示新基因AngRem10 4 /pEGFP融合基因真核表达载体在真核细胞COS 1中获得了表达 ,细胞所表达的融合蛋白具有An gRem10 4和EGFP的双重活性 ,可用荧光显微镜直接观察其表达情况及亚细胞定位 ,为基因功能研究提供了线索。

人肾小球系膜细胞增生硬化相关新基因AngRem104的表达和功能研究

目的 :AngRem10 4 (angiotensinⅡrelatedgenesinmesangialcells)是血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )刺激系膜细胞后上调表达的新基因 (GenBank登录号是AF36 7870 )。本研究旨在进一步探讨新基因AngRem10 4的功能 ,为研究肾小球增生硬化可能的分子机制奠定基础。方法 :用Northernblot检测AngRem10 4在正常人组织中的表达分布及其在AngⅡ刺激和刺激被losartan阻断后的表达变化。构建AngRem10 4与pcDNA3 1/V5 /His -TOPO的正义和反义真核表达载体 ,并转染至体外培养人肾小球系膜细胞 ,用RT -PCR的方法检测在AngRem10 4基因过度表达时纤粘连蛋白(FN)的表达变化。通过ExPASy对AngRem10 4进行生物信息学分析。结果 :生物信息学分析提示AngRem10 4是一种核蛋白。Northernblot结果显示AngRem10 4在正常人心脏、胎盘、肝脏、骨骼肌、肾脏和胰腺组织中广泛的表达 ,而在脑组织和肺中未检测到表达。在AngⅡ刺激人系膜细胞后 6h ,AngRem10 4表达明显上调 ,并可持续至 4 8h ,但却剂量依赖地被AngⅡI型受体 (AT1R)拮抗剂 (losartan)抑制。用RT -PCR的方法检测到在AngRem10 4基因过度表达时FN的表达明显上调 ,而当反义阻断AngRem10 4基因的表达时 ,在AngⅡ刺激下人系膜细胞FN的表达无明显改变。结论 :AngRem10 4是在正常人组织内?

新基因AngRem104对纤粘连蛋白基因上游序列的调控分析

目的:探讨新基因AngRem104对纤粘连蛋白(FN)基因启动子转录活性的影响,为揭示AngRem104对FN表达的调控机制提供线索。方法:构建了FN基因上游调控序列的系列缺失体-荧光素酶(luciferase)报告基因,瞬时转染人系膜细胞,检测报告基因的活性变化。结果:FN507-pGL3+正义AngRem104质粒转染组和FN1280-pGL3+正义AngRem104质粒转染组的luciferase相对活性较FN122-pGL3+正义AngRem104质粒转染组luciferase相对活性明显升高(P<0.01)。结论:在FN基因上游调控序列中-122到-507之间存在新基因AngRem104的正反应调控区。

迷宫栓孔菌热激蛋白基因的生物信息学与表达分析

为了探究迷宫栓孔菌(Trametes gibbosa)热激蛋白(heat shock proteins,HSPs)家族的功能及结构,对经木屑处理不同时间点的菌丝样品进行cDNA建库,然后根据转录组数据筛选该菌株的所有HSPs基因并进行生物信息学分析;针对HSP100家族进行基因克隆和序列结构分析,并利用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)对其在木屑处理下的表达量进行验证。结果如下:在迷宫栓孔菌中共筛选出32个HSPs基因,其编码的蛋白分为5个亚类,分别为HSP100(2个)、HSP90(2个)、HSP70(7个)、HSP60(1个)和小分子热激蛋白[small HSPs(sHSPs),20个],它们在菌体生长调控中具有蛋白翻译后修饰、蛋白质折叠、伴侣蛋白等重要功能。这些HSPs都为疏水蛋白,不同亚类的HSPs理化性质有所差异。HSP100由N-端、核苷酸结合域1(nucleotide-binding domain 1,NBD1)、NBD2、2个NBDs间的接头构成,其中,NBDs具有十分保守的Walker A、Walker B基序及精氨酸指残基。qRT-PCR扩增结果表明,在木屑处理下迷宫栓孔菌HSP100基因表达量有明显上调趋势。综上所述,迷宫栓孔菌中HSPs家族种类多且复杂,在应激情况下HSP100家族承担了重要的蛋白质解聚功能,其序列及结构相对保守。本研究结果为迷宫栓孔菌在胁迫应激方面的研究提供了理论依据。

小麦品种保丰104抗白粉病基因的遗传分析

小麦品种保丰104具有良好的抗白粉病特性。为了解其抗病性的遗传基础,利用保丰104/辽春10号得到F2分离群体和F2:3家系,对其苗期抗病性进行了鉴定和遗传分析,并对其所携带的抗病基因进行了独立性测验及分子标记定位。结果表明,保丰104可能含有两个抗白粉病基因,其中一个抗白粉病基因与Xcfd81紧密连锁,可能是Pm2,另一个与CINAU127紧密连锁,可能是Pm6。

猪A组轮状病毒Vp4全基因在MA-104细胞中的表达与DNA疫苗的研究

本研究采用LipofectamineTM2000将真核重组表达质粒pVAXI-Vp4转染至MA-104细胞中,得到了表达。以荧光抗体检测法和RT-PCR法双重检测了真核重组表达质粒pVAXI-Vp4在MA-104细胞中的表达情况。并将pVAXI-Vp4免疫BALB/c鼠,检测其血清抗体和脾脏中的淋巴细胞增殖情况及CD4+,CD8+T细胞的数量变化情况。结果表明,猪A组轮状病毒Vp4全基因不但在哺乳动物细胞中获得了表达,而且将真核重组表达质粒pVAX-I-Vp4给动物免疫后,获得了免疫效果。这为pVAXI-Vp4DNA核酸疫苗的进一步推广应用提供了科学依据。

过表达非洲猪瘟病毒D1133L蛋白的MA-104细胞系建立及其初步应用

旨在研究非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)编码的D1133L基因功能,本文利用慢病毒表达系统构建了过表达D1133L的MA-104/D1133L细胞系,分析ASFV在MA-104/D1133L细胞系与MA-104细胞中的复制差异。利用RT-qPCR和Western blot技术分别检测了ASFV感染MA-104/D1133L细胞后p30和p72基因的转录和蛋白表达水平,同时测定病毒滴度和病毒拷贝数评价ASFV的复制能力。结果表明:ASFV p30和p72基因在MA-104/D1133L细胞系的转录和蛋白表达水平高于野生型细胞系,ASFV在MA-104/D1133L细胞系的病毒增殖能力高于野生型细胞。本研究成功构建了过表达ASFV D1133L基因的MA-104/D1133L细胞系,与野生型细胞相比,D1133L能促进ASFV增殖,MA-104/D1133L细胞系更利于ASFV的复制,本结果为进一步研究ASFV D1133L基因功能积累了生物材料。

新基因AngRem104与糖皮质激素受体特异延伸因子的相互作用

目的应用免疫共沉淀技术,验证新基因AngRem104和糖皮质激素受体特异延伸因子(GR-EF)蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用,为进一步研究AngRem104的生理功能奠定基础。方法构建AngRem104-pcDNA3.1/V5-His和GR-EF-pCMV/c-myc融合表达载体,共转染HEK293T细胞。分别用小鼠抗人c-myc单克隆抗体和小鼠抗人V5-HRP抗体进行免疫沉淀和免疫印迹,以验证AngRem104和GR-EF蛋白间的相互作用。结果AngRem104-V5融合蛋白能够在c-myc抗体的免疫沉淀物中检测出来;在V5抗体的免疫沉淀物中也能检测到GR-EF-c-myc融合蛋白。结论新基因AngRem104和GR-EF蛋白在哺乳动物细胞中存在直接相互作用。

采用基因表达谱芯片技术筛选新基因AngRem104的功能相关基因

目的 采用基因芯片技术来筛选新基因AngRem104的功能相关基因,为进一步的基因功能研究提供线索。方法 建立新基因AngRem104的正义和反义表达的系膜细胞模型,应用含有4000个人类基因的cDNA表达谱芯片,对过量表达AngRem104基因和抑制表达AngRem104基因的人肾小球系膜细胞RNA表达进行检测。部分基因的差异表达由RT-PCR方法来验证。结果 筛选出的差异表达基因共96个,其中94个基因上调表达,2个基因下调表达。差异表达的基因涉及到细胞外基质和受体蛋白、细胞信号传导相关基因、DNA结合及转录相关蛋白、免疫相关蛋白、细胞骨架和动力蛋白和细胞合成及代谢相关蛋白等。特别是纤连蛋白(FN)及整合素β1(integrin β1)表达明显上调。RT-PCR的方法也证实了AngRem104与FN表达的相关性。结论 应用作为研究基因功能有效手段的基因表达谱芯片技术来筛选新基因AngRem104的功能相关基因,发现AngRem104与FN的表达有关,为其功能研究提供了重要线索。

ATP6V0A1基因变异致发育性癫痫性脑病104型1例患儿的临床表型及遗传学分析

目的探讨1例癫痫性脑病(DEE)患儿的临床表型及遗传学病因。方法收集2021年2月就诊于广东医科大学附属医院儿童医学中心的1例患儿的临床资料进行回顾性分析。采集患儿及其父母的外周血样,对其进行全外显子组测序,对候选变异进行Sanger测序验证。以"ATP6V0A1基因""发育性及癫痫性脑病104型""ATP6V0A1 variant""developmental and epileptic encephalopathy 104""DEE 104""epileptic encephalopathy"为关键词检索中国知网、万方数据平台以及PubMed数据库中的相关文献,检索时间为建库至2022年12月。结果患儿为5月龄男性,婴儿期起病,表现为频繁的局灶性发作,伴严重发育落后,体型消瘦、小头畸形、外眦上斜,精灵耳,四肢肌张力低下。患儿脑电图提示多灶性尖波、慢波、棘慢波发放,头颅MRI发现双侧侧脑室、第三脑室扩大,脑沟、脑裂、脑池增宽。测序结果提示患儿ATP6V0A1基因存在c.2401C>T(p.His801Tyr)新发错义变异,判读为可能致病性(PS2+PM2_Supporting+PP3)。结合患儿的临床表型和基因检测结果,确诊其为DEE104型。共检索到ATP6V0A1基因变异所致DEE104型文献2篇,共14例。DEE104型患者变异以杂合变异为主,热点变异为c.2219G>A(10/14,71.4%),最常见的临床特征为难治性癫痫发作及发育迟缓(14/14,100.0%)。结论患儿考虑为ATP6V0A1基因c.2401C>T的杂合变异所致的癫痫型脑病104型。