The metabolism of constituents of Huangqin- Tang decoction,a traditional Chinese medicinal preparation,in conventional, germ-free and gnotobiote mice

ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎＩｎｔｅｓｔｉｎａｌｂａｃｔｅｒｉａｐｌａｙａｎｅｓｓｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｉｎｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｍａｎｙｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓｉｎｖａｒｉｏｕｓｍｅｄｉｃｉｎａｌｈｅｒｂｓｔｏｔｈｅｉｒａｇｌｙｃｏｎｅｓ[1] .Ｓｏｍｅｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓｏｆｈｅｒｂｓａｒｅｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄｔｏｂｅｍａｉｎｃｏｍｐｏ ｎｅｎｔｓｉｎｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｒｍｅｄｉｃｉｎｅｅｆｆｅｃｔｓ[2 ] .Ｉｎｐｒｅｖｉｏｕｓｐａｐｅｒ ,ｕｓｉｎｇａｎＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄｅｓ ｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｏｕｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ,1 5ｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｏｒｉｇｉｎａｌｃｏｍｐｏｕｎｄｓｉｎｔｈｅｔｒａ ｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎａｌｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎＨｕａｎｇｑｉｎ ＴａｎｇａｎｄｔｈｅｉｒｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｂｙＨＩＢｗｅｒｅｓｉ ｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ .ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓｏｆＨｕａｎｇｑｉｎ ＴａｎｇＢＧ ,ＷＧ...

无菌鼠细菌检测方法的选择与探讨

目的 比较培养法、革兰染色镜检法和16S rRNA PCR方法对无菌小鼠粪便样品细菌检测的检测性能,为无菌鼠细菌检测方法的选择提供依据。方法 利用培养法、革兰染色镜检法、16S rRNA PCR方法,分别检测GF小鼠粪便、SPF小鼠粪便以及已知含菌量的测试样品(无菌小鼠粪便与金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌混合,人为制作而成),验证3种方法对无菌小鼠粪便中细菌的检测限度;并同时使用3种方法检测临床样品,对比3种检测方法的优缺点,分析3种方法在实际检测中的可行性。结果 培养法、革兰染色镜检法和16S rRNA PCR方法检测灵敏度分别为102CFU/g、108CFU/g和106CFU/g,临床样品检测中阳性率均为1.36%(6/441)。结论 培养法、革兰染色镜检法、16S rRNA PCR法3种检测方法各有优缺点,需要联合使用,取长补短,确保检测结果的可靠。

移植不同饲料利用效率猪的粪便可定向改变伪无菌小鼠的生长性能

目的通过将不同饲料利用效率猪的粪便移植至伪无菌小鼠,探讨其对受体小鼠生长性能的影响规律,并初步揭示其机制。方法使用36头28 kg左右的杜×长×大阉公猪进行42 d单笼饲养(自由采食)并测算其饲料转化效率。实验结束时将36头猪根据饲料转化效率分为高、中、低3组,采集三组猪的新鲜粪便,通过灌胃移植到经广谱抗生素处理过的小鼠中,监测粪便移植后小鼠的生长性能变化。采用全收粪法测定饲料利用效率高、中、低三组猪的营养物质消化率,并采用16S rRNA V3-4可变区扩增测序对猪和小鼠的粪便微生物组成进行分析比较。结果将不同饲料利用效率猪的粪便移植至广谱抗生素处理的伪无菌小鼠后,小鼠重现了猪的生长性能表型;在肠道微生物的组成结构方面,高饲料转化效率猪及其高生长性能的受体鼠,肠道微生物的物种丰富度和微生物多样性相对较高;高饲料利用效率猪的总能消化率(P=0.01)显著增加,产气短杆菌的丰度显著提高,且其粪便移植后受体小鼠的肠球菌和阿克曼氏菌丰度也显著高于低饲料利用效率的受体小鼠,表明肠道微生物在能量的高效利用方面起着重要的作用。结论移植不同饲料利用效率猪的粪便可定向改变伪无菌小鼠肠道微生物的物种丰富度、微生物多样性及其生长性能。高饲料利用效率猪的优势主要在于能量消化利用效率较高,肠道中与能量高效利用相关微生物丰度相对较高。

新疆哈萨克族肥胖儿童菌群人源化动物模型的建立

目的利用无菌小鼠建立新疆哈萨克族肥胖儿童菌群人源化（HFA）动物模型,为深入研究哈萨克族儿童肥胖的病理生理机制提供新的研究方式。方法收集新疆哈萨克族7-13岁肥胖儿童新鲜粪便,男女各10例。20只3周龄无菌级C57BL/6J小鼠（雌雄各半）,按照性别进行分组并编号。小鼠灌胃接种哈萨克族肥胖儿童粪便菌悬液0.1 ml/次,隔日一次,共接种3次,且接种时遵循性别一致原则。于接种后第7天收集小鼠新鲜粪便标本,提取基因组DNA后,采用特异性引物对16S rRNA V3区进行PCR扩增,对扩增产物运用DGGE方法分离并鉴定,以了解HFA动物模型中肠道菌群的定植情况。结果接种哈萨克族肥胖儿童肠道菌群后的无菌小鼠盲肠均减小为正常小鼠大小;HFA动物模型的PCR-DGGE指纹图谱显示各观察标本均形成复杂而多样的菌属条带。结论本实验成功利用无菌C57BL/6J小鼠建立哈萨克族肥胖儿童HFA动物模型,该动物模型是探索哈萨克族儿童特征性肥胖与肠道菌群关系的新的选择方式。

无菌小鼠在肠道菌与机体免疫互作机制研究中的应用

肠道菌在机体健康中发挥重要作用,而其中肠道菌发挥作用的具体机制是什么?无菌小鼠作为一种动物模型,在研究肠道菌作用机制的研究中必不可缺。本综述以无菌小鼠模型为基础,探讨肠道菌对机体系统发育、维持中的作用,并重点讨论一些特有的肠道菌在免疫调控中的具体作用。

无菌鼠模型制作方法与评价

无菌动物特别是无菌大鼠、小鼠的成功培育技术成为研究微生物与人类生命现象关系的关键技术。严格的无菌动物是指在动物体宿主内外任何部位及生活环境中均检测不出一切生命体。广义的无菌动物还包括清除肠道中大部分菌群的动物,又称为伪无菌动物。目前制作无菌鼠的方法主要有剖腹取胎无菌饲养法制作无菌鼠模型,抗生素鸡尾酒法制作伪无菌鼠模型。本文对无菌鼠模型的制作方法进行总结并对其优缺点进行评价。

肠道正常菌丛对轮状病毒感染拮抗作用的病理观察

新生无菌ＢＡＢＣ／Ｌ小鼠投以６种肠道正常细菌，于第５日龄感染鼠轮状病毒，每日处死动物２只，直到第５天，实验２组动物（肠道正常菌丛＋，轮状病毒＋）较实验１组动物（肠道菌丛－，轮状病毒＋）腹泻出现晚、恢复快，肠绒毛上皮细胞水样变性轻、范围小、炎性细胞浸润明显。

肠道菌群影响无菌小鼠对卵清蛋白的敏感性

目的通过观察过敏和无过敏反应小鼠肠道菌群在无菌小鼠肠道内定植后对卵清蛋白(OVA)刺激的反应,探究肠道菌群在食物过敏中的作用。方法采集用卵清蛋白成功诱导出的过敏和无过敏反应SPF级小鼠的粪便,分别移植给无菌小鼠(各10只),为过敏组(FA组)和无过敏反应组(NR组)。粪菌移植后第3周,两组分别随机抽取7只再用OVA激发为实验组(FA-o组、NR-o组),余3只为生理盐水对照组(FA-c组、NR-c组)。用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术评价粪菌移植后肠道菌群在肠道内的定植情况,比较FA组和NR组肠道菌群的差别。观察两组再用OVA激发后的临床表现,HE染色观察小鼠空肠组织形态学改变。结果 (1)粪菌移植后第3周,与供体小鼠相比,FA组与NR组小鼠肠道菌群的DGGE条带多数一致,而FA组与NR组肠道菌群比较,DGGE条带有明显不同,聚类分析和主成分分析(principal component analysis,PCA)两组均能很好分离,测序结果也表明无过敏反应组中厚壁菌门的细菌占优势,过敏组中变形菌门的细菌占优势;(2)移植粪菌的无菌鼠再次用OVA激发时,FA-o组有临床表现,NR-o组无明显临床表现;HE染色可见FA-o组较NR-o组小鼠空肠绒毛上皮细胞局灶性坏死、脱落,炎性细胞浸润明显严重。结论肠道菌群不同使无菌小鼠对OVA的敏感性不同,说明肠道菌群的变化可能是食物过敏的始动因素,肠道菌群可传递宿主对食物过敏的敏感性。

无菌小鼠在肠道菌群研究中的应用概述

人类胃肠道中有10~100万亿微生物,这些微生物归属于9个细菌门,其中厚壁菌门和拟杆菌门微生物占了绝大多数^([1-3])。近年来,越来越多的研究证实,肠道菌群与肥胖相关疾病、心血管疾病、代谢性疾病、肝病、炎症性肠病和结直肠癌存在联系,并在调节胰岛素敏感性、脂肪储存和体重方面发挥关键作用^([4-8])。在人体中,与基因相比,肠道菌群更具可塑性,其组成随年龄和饮食等因素而变化,因此有可能通过调节肠道菌群的组成来预防和治疗疾病。总的来说,肠道菌群的研究对维护人类健康具有重要意义。

建立阿尔茨海默症人源肠道菌群动物模型

目的使用粪菌移植方法经口途径获得阿尔茨海默症人源肠道菌群(human flora-associated,HFA模型小鼠,并通过生物信息学、组织病理学等方法对模型进行评价。方法无菌雌性C57BL/6J小鼠28只,随机分为阿尔茨海默症模型(AD)组和对照(CON)组,分别经口途径接种阿尔茨海默症患者及健康志愿者的新鲜粪便悬液,在移植6、10周后每组安乐7只动物,取粪便进行16S r DNA检测;取脑组织和血液进行Aβ含量、细胞因子检测,脑组织进行组织病理学检查。结果CON组与AD组动物体重增长差异无显著性。α-多样性分析,在造模后两个时间点AD组Simpson指数升高(P<0.05,P<0.01),ACE(P<0.05)和Chao1(P<0.05),Shannon指数降低(P<0.05,P<0.01),与CON组比较差异有显著性。在科水平,AD组拟杆菌科丰度升高(P<0.01,P<0.05),毛螺菌科(P<0.001)、消化链球菌科(P<0.01)丰度降低;在属水平,AD组拟杆菌属丰度升高(P<0.01,P<0.05),梭菌属(P<0.01,P<0.05)、毛螺菌属(P<0.01,P<0.0001)、寄生菌属(P<0.01,P<0.001)丰度降低,与CON比较差异有显著性。β-多样性分析结果,AD组、CON组不同时间点肠型分布在相同区域,不同组别肠型分布在不同区间。2组动物的肠道菌群在微生物物种构成方面存在显著性差异(P<0.05)。AD组小鼠在建模10周时血液和脑中Aβ40含量升高(P<0.05,P<0.01),与CON组比较差异有显著性。与老年斑形成相关的细胞因子检测,IL-1β在建模6周时浓度降低(P<0.05);IL-10在建模6周时升高(P<0.01);TGF-β在建模10周时浓度降低(P<0.01),与CON组比较差异有统计学意义。组织病理学检查未见老年斑生成。结论本研究通过接种患者粪便悬液的方法建立了阿尔茨海默症人源菌群小鼠模型,模型小鼠肠道菌群的结构丰度、与老年斑生成相关细胞因子含量等指标的改变与阿尔茨海默症病人的临床表现类似。

GF级KM小鼠生长曲线、主要脏器参数及生理生化指标的测定分析

目的采用对SPF级KM小鼠进行剖宫产术,用无菌奶妈代乳方法,培育出GF级(即无菌级)KM小鼠,了解GF级KM小鼠的生长发育并绘制出生长曲线;测定其不同生长阶段的主要脏器重量及血液生理生化值并进行比较分析。方法①分别称取60只(雌雄各半)0～112日龄GF级KM小鼠体重,绘制其生长曲线;②随机抽取28、56、112日龄的KM小鼠60只(雌雄各半),活体称重,依次剖取心、肝等主要脏器称重;③小鼠眼眶采血,测定其血常规和生化值。结果 GF级KM小鼠的体重随着日龄的增长而逐渐增加,断奶后1～2周内增重最为迅速,4周后的雄鼠体重明显高于雌鼠;主要脏器(心、肝、脾、肺、脑等)重量随年龄增大均逐渐增加,盲肠体积增大尤其明显,而胸腺随着日龄的增加而逐渐萎缩,其重量迅速减轻;同一日龄GF级KM小鼠的雌雄间血常规和生化值指标均存在差异,但随着年龄的增加差异的项目逐渐增多。结论 GF级KM小鼠生长发育和血液生理生化的研究结果可为KM小鼠的标准化及最终成为国际标准品系提供基础数据。

冠心病人源肠道菌群小鼠模型的建立及评价

目的通过粪菌移植方法建立冠心病人源肠道菌群(human flora-associated,HFA)小鼠模型并对模型进行评价。方法28只无菌雌性C57BL/6J小鼠分为对照(CON)组和模型(CAD)组,分别接种健康志愿者和冠心病患者新鲜粪便悬液,移植后6周和10周每组安乐7只动物,取粪便、血液、主动脉进行16S rDNA、血脂、细胞因子和组织病理学检查。结果从第5周开始CAD组动物体重增长加快(P<0.05)。α-多样性分析,CAD组的Simpson指数在两个时间点的数值均升高(P<0.05,P<0.01),Shannon指数(P<0.05,P<0.01)、ACE(P<0.05)和Chao1指数均降低(P<0.05)。CON组reads主要分布在厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、梭杆菌门(Fusobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、蓝藻菌门(Cyanobacteria)、软壁菌门(Tenericutes)。造模6周时,CAD组厚壁菌门、软壁菌门丰度降低(P<0.05),拟杆菌门、疣微菌门丰度升高(P<0.01);造模10周时,CAD组厚壁菌门丰度降低(P<0.01),拟杆菌门、疣微菌门丰度升高(P<0.01)。β-多样性分析,CAD组、CON组的肠型分布在不同区域,同一组的不同阶段则分布在相同区域。CAD组与CON组在微生物物种构成方面存在显著性差异(P<0.05)。CAD组小鼠在建模6周和10周时血液中甘油三酯(TG)(P<0.05,P<0.01),胆固醇(TC)(P<0.05),乳酸脱氢酶(LDH)(P<0.01,P<0.0001)和磷酸激酶(CK)(P<0.01,P<0.05)值均升高。低密度脂蛋白(LDL-C)在建模6周时升高(P<0.05)。细胞因子检测,IL-6在建模6周时浓度升高(P<0.05),10周时减低(P<0.00001);IL-10在建模10周时浓度降低(P<0.05);IL-2、IL-4、IL-5、IL-1β在建模10周时浓度升高(P<0.0001,P<0.05,P<0.0001,P<0.01)。IL-12p70、TNF-α、INF-γ在两个时间点差异无统计学意义。CAD组及CON组小鼠的冠状动脉苏木素-伊红(H.E)染色在建模后两个时间点均未见泡沫细胞形成等动脉粥样硬化改变。结论本研究利用粪菌移植方法获得冠心病人源菌群小鼠,肠道菌群结构丰度、体重、血脂、细胞因子含量等指标出现了与临床类似的改变。

末端回肠组蛋白脱乙酰基酶3表达与肥胖以及肠道菌群关系的初步探索

背景:表达于肝脏、肌肉和脂肪组织中的组蛋白脱乙酰基酶3(HDAC3)与脂肪代谢密切相关;而肠上皮细胞中的HDAC3可调节宿主与肠道菌群之间的相互作用,维持肠道内环境稳态。目的:探讨末端回肠HDAC3表达与肥胖以及肠道菌群的关系。方法:8只6周龄SPF C57BL/6小鼠和8只6周龄无菌C57BL/6小鼠分别随机分为普通饮食组和高脂饮食组,予喂饲相应饲料5周,每周记录体质量变化。获取末端回肠组织,以免疫组化染色和realtime PCR检测HDAC3蛋白和mRNA表达。结果:与SPF普通饮食组相比,SPF高脂饮食组小鼠体质量增长明显(P<0.05),末端回肠HDAC3蛋白和mRNA表达均显著增高(P<0.05)。无菌高脂饮食组和无菌普通饮食组小鼠实验过程中体质量无明显变化(P>0.05),两组间HDAC3蛋白和mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:肠道菌群对末端回肠HDAC3表达可能具有潜在调节作用,进而参与肥胖发生。

无菌鼠模型在结直肠癌研究中的应用

越来越多的证据表明,肠道微生物群的组成与结直肠癌的发生发展密切相关。无菌动物模型,尤其是无菌鼠模型简单、易获得,为研究微生物群、结直肠肿瘤及机体间的复杂关系提供了重要工具。无菌鼠模型的建立主要通过剖腹产及无菌隔离器饲养和繁育来实现。在此基础之上,可以根据特定的研究目的,建立转基因或药物诱导的特殊类型无菌鼠模型。目前,无菌鼠模型在结直肠癌研究中已经得到了广泛应用。基于无菌鼠模型的研究结果表明,微生物或微生物群可以激活免疫和诱发炎症,从而促进结直肠癌的发生发展;同时也证明,微生态失衡与结直肠癌的发生发展相辅相成、互为因果关系。由于无菌鼠模型是研究微生态失衡所致的结直肠癌及相关疾病研究重要且有效的研究载体,因此,值得进一步推广应用。

无菌APPswe/PS1ΔE9双转基因小鼠模型建立及脑内斑块变化初步观察

目的 使用剖宫产净化方法建立无菌APPswe/PS1ΔE9(PAP)双转基因小鼠模型并对动物脑内斑块沉积情况进行初步观察,为研究肠道菌群与阿尔茨海默症关系提供新的动物模型。方法 选择阳性PAP雄性杂合子鼠与经产的C57野生型雌鼠1∶2进行交配。怀孕母鼠在超净工作台内行剖宫产手术,用无菌ICR小鼠代乳。术后每个月进行无菌状态检测;PCR方法检测剖宫产所得PAP仔鼠的基因型;免疫组化方法定量检测9月龄PAP小鼠脑内斑块变化情况。结果 实施剖宫产手术12例,获仔鼠66只,剖宫产存活率及离乳存活率分别为95.45%(63/66)和95.24%(60/63),净化后按国标检测无菌状态均为合格。免疫组化结果显示9月龄无菌PAP小鼠海马内斑块较同月龄SPF级动物减少。结论 通过剖宫产净化技术去除了PAP小鼠携带的菌群,9月龄无菌PAP小鼠脑内斑块减少。

实验小鼠肠道微生物的研究现状

本文就影响实验小鼠肠道微生物菌群组成的因素以及无菌（GF）小鼠的肠道微生物研究现状作了概述，为进一步了解和研究人类和动物肠道微生物提供依据。

动物模型移植人源肠道菌群在中医药防治糖脂代谢病中的关键技术和挑战

糖脂代谢病是影响和危害全球公共健康的一类重大疾病。近年来,越来越多的证据指向糖脂代谢病和肠道菌群结构和功能改变密切相关。但是,临床研究很难在人群进行干预试验揭示肠道菌群改变与疾病核心机理的因果关系。因此,动物模型移植人源肠道菌群成为揭示中医药等干预策略或临床特征与肠道菌群改变因果关系的关键研究策略之一。动物模型移植人源肠道菌群研究方法主要包括4个主要步骤:1)采集观察组和对照人群的的粪便,进行移植菌液制备; 2)广谱抗生素诱导的条件性无菌小鼠诱导; 3)运用整体菌群或经宏基因组学分析鉴定出的特异性菌属,移植到条件性无菌小鼠后,进行代谢性疾病动物模型诱导; 4)比较分别接受干预组和对照组人源肠道菌群移植小鼠的糖脂代谢表型。作为肠道菌群研究领域的前沿方法之一,动物模型移植人源肠道菌群为中医药防治糖脂代谢病提供了新思路和线索。

两种不同品系小鼠的人源菌群模型的建立与肠道菌群的比较

目的比较KM(封闭群)和C57BL/6J(近交系)两种小鼠人源菌群(Human flora-associated,HFA)模型的构建过程中小鼠肠道菌群的动态变化以及定植效果。方法通过向无菌KM和C57BL/6J小鼠体内同时灌喂同一健康人的新鲜粪便,于灌喂后1、2和4周分别收集小鼠新鲜粪便。采用变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)技术评价人肠道菌群在两种无菌小鼠体内的定植规律和定植效果。结果两种小鼠的菌群条带数随时间的推移而明显增加,到第4周,两种品系的小鼠的菌群的一致性均略有增高,趋于稳定。UPGMA聚类分析显示,两种小鼠分别聚在了不同的聚类枝上;并且二者在Shannon-Wiener指数上差异有统计学意义(P<0.05),在条带数S和与供体人的相似性差异有统计学意义(P<0.01),且C57BL/6J HFA小鼠模型更接近人。结论不同遗传背景的小鼠对肠道菌群具有选择性的定植效果,在多样性和与供体菌群的相似性方面,C57BL/6J HFA小鼠模型要优于KM HFA小鼠模型。

肥胖患者HFA小鼠模型的建立

目的研究肥胖患者的肠道菌群在无菌小鼠体内的定植规律。方法选取20只无菌KM小鼠,接种肥胖患者的粪便,构建菌群人源化(HFA)动物模型,利用变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)评价患者肠道菌群在无菌小鼠体内的定植规律。结果 HFA小鼠菌群平均丰富度(richness,S)为12.04±3.68,肥胖患者的条带S为24,为HFA小鼠S的2倍;肥胖患者Shannon指数(H')为3.02,HFA小鼠平均H'为2.46±0.33;HFA小鼠与人肠道菌群的总相似度为26%;大部分雌性HFA小鼠与雄性HFA小鼠在聚类分析图上分离,且雄性HFA小鼠与患者更为相似。结论HFA小鼠体内能部分模拟肥胖患者的微生物区系,且与患者性别相同的小鼠模拟得更好。本实验建立的HFA模型为肥胖与肠道菌群关系的进一步研究提供新的选择。

大豆异黄酮对无菌小鼠脂代谢的影响

目的通过无菌(GF)小鼠模型研究大豆异黄酮(SI)对脂代谢的影响,探讨肠道菌群在大豆异黄酮调节脂代谢中的作用。方法用高脂饲料饲养GF小鼠,并选择低、中、高剂量SI对其进行干预,干预4周后,检测血液中血脂指标和抗氧化指标,称量肝脏、肠和心脏重量后进行比较。结果高脂饲料使GF小鼠血液中总胆固醇、甘油三酯水平升高,同时出现肝脏、肠重量增加,心脏重量减小,SI具有减小肠重量增加幅度和心脏重量降低幅度的保护作用。SI能提高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)水平,但在GF小鼠实验中未见SI提升抗氧化功能的作用。结论 SI对高脂饮食下的心脏和肠道有保护作用,且能提高HDL-c,预防动脉粥样硬化的发生,提示SI对脂代谢的有益作用不完全依赖于其肠道菌群代谢产物雌马酚。