结核分枝杆菌glcB基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆glcB基因原核表达载体，并进行表达，纯化。方法用PcR扩增结核分枝杆菌glcB基因，并克隆入pTA2质粒。测序正确后，再亚克隆入pET30a（＋）质粒，构建pET30a（＋）：glcB重组体。结果以重组体转化BL21（DE3）后，经0．4mM异丙基硫代-β．D．半乳糖苷（IPTG）诱导，表达出分子量为92KD重组蛋白。SDS—PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中，表达量占全菌蛋白质的50％。经Ni-NTA柱纯化，获得纯度为90％的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a（＋）：glcB，并获得GIcB重组蛋白，为血清学诊断活动性结核病奠定了基础。

结核分枝杆菌H37Rv基因glcB的克隆、表达及酶活性的实验研究

目的应用大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达有活性的结核分枝杆菌H37Rv分泌蛋白GlcB(80.4kDa),为早期结核病的诊断以及新的抗结核药物的研制提供理论依据。方法应用聚合酶链反应(PCR)扩增结核分枝杆菌的基因glcB(Rv1837c),并与克隆载体PCR4BLUNT-TOPO连接,DNA测序后,经酶切将glcB与表达载体pET23b连接,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中表达目的蛋白GlcB。IPTG诱导表达,破菌,离心,采用Ni2+亲和层析法纯化上清液中的目的蛋白,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测重组蛋白的表达及纯度;同时应用抗6个组氨酸的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)进行固定化蛋白质免疫学测定(Western blot),并进行了酶活性的分析。结果PCR产物序列正确,GlcB可在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中高效表达,可溶性好。经SDS-PAGE结合考马斯亮蓝染色及Western blot检测证实,表达的重组蛋白纯度高,与预期的GlcB大小一致,约80kDa。活性分析提示该重组蛋白具有苹果酸合成酶的功能,且酶活性为5.5μmol/(min·mg),与相关的文献报道一致。结论结核分枝杆菌H37Rv分泌蛋白GlcB能够在大肠杆菌中高效表达,且具有酶活性,有望为新一代抗结核药物的研制及结核早期诊断提供依据。

结核分枝杆菌GLCB蛋白的生物信息学分析

目的对结核分枝杆菌Rv1837c基因编码蛋白GLCB的结构和功能进行生物信息学分析和预测。方法自GenBank数据库中获取Rv1837c全部基因信息,运用ProtParam及ProtScale分别预测其编码的glcB蛋白理化性质和亲疏水性;使用SignalP,NetPhos和TMHMM分析glcB的信号肽、磷酸化位点、跨膜螺旋;分别利用SOPMA,SWISSMODEL分析glcB蛋白的二级结构并建立三级结构模型;利用Vaxijen v2.0进行抗原性分析并用ABCpred预测glcB蛋白的B细胞抗原表位。结果Rv1837c基因全长2226bp,其编码的glcB蛋白含有741个氨基酸残基,疏水系数-0.1545,为亲水性蛋白,不稳定指数为33.81,定义其为稳定蛋白。glcB蛋白无信号肽和跨膜蛋白,含有大量磷酸化位点及B细胞抗原表位。结论生物信息学分析glcB蛋白为亲水性蛋白,具有潜在多个抗原表位,可作为结核病疫苗研发的候选蛋白。

大孔树脂对灵芝发酵液中抗氧化物质的分离纯化的研究

研究了几种大孔树脂对灵芝发酵液正丁醇萃取相(GLCB)的分离作用。结果表明:HPD400对GLCB具有分离和纯化的作用, HPD400的分离条件为:上样液的pH为4.0,上样液速度为2 BV/h,最大吸附量为82.0 mg/g,依次用10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%和100%的乙醇溶液进行洗脱,结果20%的乙醇洗脱量最高, DPPH活性最高,收集20%乙醇洗脱液。