耻垢分枝杆菌glmU基因克隆、表达及多克隆抗体的制备

目的:制备抗耻垢分枝杆菌(Smeg)GlmU的多克隆抗体,并对其特异性进行鉴定。方法:用PCR技术扩增SmegglmU,构建可在大肠杆菌中表达的重组质粒pET29b-SmegglmU,用IPTG诱导表达,经Ni-NTA-Agarose柱层析纯化后,以其为免疫原制备抗SmegGlmU的多克隆抗体,并以间接ELISA方法测定抗体效价,以Western blot方法鉴定抗体的特异性。结果:在大肠杆菌中得到了可溶性表达的SmegGlmU;以其免疫小鼠获得抗血清,Western blot鉴定显示获得了能特异性地作用于耻垢分枝杆菌GlmU的多克隆抗体,ELISA测定表明其效价高于1∶6400。结论:获得了能特异性地作用于耻垢分枝杆菌GlmU的高效价多克隆抗体,为应用反义RNA技术研究glmU基因的功能奠定了基础。

灵芝提取物对耻垢分枝杆菌GlmU基因表达的影响

目的研究灵芝水提取物、灵芝三萜对耻垢分枝杆菌(M.S-155)增殖曲线、GlmU基因表达、细胞壁结构的影响。方法将6×107 M.S-155接种用含有500μg/mL灵芝水提取物、灵芝三萜的LB培养基培养耻垢分枝杆菌作为实验组,6×107 M.S-155单独培养作为对照,取不同时间A600值绘制耻垢分枝杆菌增殖曲线,用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白免疫印迹(Western blotting)检测GlmU蛋白表达情况,透射电子显微镜(TEM)观察细胞壁的形态变化。结果增殖曲线说明灵芝水提取物、灵芝三萜对耻垢分枝杆菌生长明显抑制,对应A600值组间有差异(P<0.05),而同等剂量的灵芝三萜抑菌能力更强;SDS-PAGE及Western blotting检测到相对分子质量51.5×103蛋白处蛋白实验组明显变暗(P<0.05);用TEM观察其对耻垢分枝杆菌细胞壁结构的影响,实验组M.S-155经灵芝三萜处理后的耻垢分枝杆菌的细胞壁明显膨胀、变形。结论灵芝水提取物、灵芝三萜对M.S-155有明显的抑制作用,而其作用位点很可能就是抑制了GlmU基因的体外表达,灵芝提取物不但能够抑制M.S-155增殖而且能够影响细胞壁功能,为进一步研究灵芝应用价值奠定了基础。

glmU基因敲除后对分枝杆菌细胞壁中聚糖影响的初步分析

应用已构建的glmU基因敲除的耻垢分枝杆菌作为实验模型,对细胞壁中的聚糖的组成成份和结构进行分析。气相色谱与高效液相Dionex的结果共同说明了在mc2155 glmU KOT菌株的细胞壁内,当缺失活性GlmU时,阿拉伯糖含量增加,且其增加是来自于具有分支的阿拉伯糖末端的增多。此结果将能更进一步地认识GlmU的功能以及当GlmU功能异常时对细菌造成的影响,这些都将为研究以GlmU为靶位点的药物对细菌的影响提供实验支持。

glmU基因单功能敲除对大肠杆菌生产氨基葡萄糖的影响

大肠杆菌中的glmU是葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶/葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶双功能基因。同源单交换方法敲除大肠杆菌中葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶单结构域基因glmU,即利用重叠PCR将葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶结构域内603bp序列与抗性基因ampR连接,经过末端单酶切(HindⅢ)后电转化至大肠杆菌(E.coli)BL21感受态细胞中,经同源臂单交换,将抗性基因ampR整合至glmU基因内部,实现该结构域功能失活的同时,保留葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶功能域活性。通过发酵实验分析glmU单结构域缺失在大肠杆菌中对氨基葡萄糖生产的影响。结果表明,发酵20h后重组菌的氨基葡萄糖产量为1 049.6mg/L,为原始菌E.coliBL21氨基葡萄糖产量103.34mg/L的10.2倍。表明glmU是影响大肠杆菌产生氨基葡萄糖的关键基因,敲除glmU基因可增加氨基葡萄糖积累。

用PCR方法定向突变结核分枝杆菌glmU基因

目的:结核分枝杆菌glmU基因是分枝杆菌生长必需基因,其编码产物具有乙酰基转移酶活性和尿嘧啶转移酶活性,参与细胞壁前体物UDP-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)的生物合成,研究其空间结构可以定向设计酶抑制剂。方法:利用PCR方法定向突变结核分枝杆菌glmU基因,并用大肠杆菌BL21(DE3)高表达m-GlmU蛋白。结果:获得了定向突变的结核分枝杆菌glmU基因,m-glmU。纯化的m-GlmU蛋白仍具有乙酰基转移酶活性和尿嘧啶核苷转移酶活性。结论:纯化的m-GlmU蛋白为进一步研究其稳定性、测定其空间结构提供了物质基础。

结核分枝杆菌UDP-N-乙酰葡糖胺生物合成及抗结核药物靶标

结核分枝杆菌是结核病的致病菌。UDP-N-乙酰葡糖胺是结核分枝杆菌细胞壁的重要糖基供体及前体分子,其生物合成由三种酶催化的四步反应完成。磷酸葡糖胺变位酶GlmM催化第二步反应,GlmU双功能酶催化最后两步反应。glmM及glmU基因敲除分别导致细菌细胞壁受损、细菌裂解及死亡,因此,GlmM和GlmU可作为研发抗结核新药的作用靶标。建立GlmM及GlmU酶活性检测方法、揭示其酶学特性、解析GlmU的晶体结构,便于人们筛选及定向设计酶抑制剂,以期发现新一代抗结核药物。