α-1,4-葡聚糖裂解酶的动力学性质研究

红藻中的α-1,4-葡聚糖裂解酶是红藻淀粉的降解酶，除了 红藻淀粉外，它还可以作用于多种底物。文中分别以PNPG和可溶性淀粉作底物，以龙须菜的 几个品系作为材料，研究了该酶促反应的动力学方面的性质。以 PNPG作为底物，该酶在60m in内酶促反应速度与保温时间成线性关系；在野生型龙须菜品系中该酶的最适反应温度是50 ℃，在两种突变型品系中是40℃；最适pH范围在4.4～5.5；底物浓度是4mmol/L时达到最大反 应速度；葡萄糖对该酶促反应有明显的抑制作用。以可溶性淀粉作为底物，在反应60 min内 酶反应速度与保温时间成线性关系；最适反应温度为50℃；最适pH范围在5.0～5.8；底物浓 度是8mg/mL时达到最大反应速度；葡萄糖对可溶性淀粉的抑制作用比对PNPG的弱。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因亚克隆研究

β-1,3-1,4-葡聚糖酶（endo-1,3-1,4- -Glucanase）能专一性地分解大麦、燕麦淀粉质胚乳细胞壁的主要成份β-1,3-1,4-葡聚糖,产生还原糖,从而提高大麦和燕麦可利用糖源的含量,促进淀粉的释放。在啤酒酿造中,该酶在提高麦芽利用率,增加麦汁浸出量,加快糖化液和啤酒的过滤速度,避免啤酒浑浊等方面均有重要作用。最近,作者从Bacillus subtilis 1.88中分离到了含bgls基因的7.1kbEcoRI DNA片段,携带该片段的重组质粒pFG（表达出专一性降解大麦β-1,3-1,4-葡聚糖的酶活性。为了研究bgls基因的结构、功能和表达等特征,我们对bgls基因进行了亚克隆。

地衣芽孢杆菌WS-6 β-葡聚糖酶基因的克隆及表达

β-葡聚糖是植物细胞壁中结构性非淀粉多糖,存在于各种饲料农作物中[1]。作为一种抗营养因子,β-葡聚糖使食糜具有很高的粘度,阻碍肠道消化液与食糜的混合,影响营养物质特别是蛋白质和脂肪的消化吸收,降低饲料的利用率。地衣芽孢杆菌分泌的β-葡聚糖酶可分解β-葡聚糖[2]。在青贮发酵过程中,这种酶可降解大麦β-葡聚糖,有效提高家畜、家禽对饲料的利用率[3]。从地衣芽孢杆菌WS-6中克隆到β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因并进行测序,将该基因与大肠杆菌表达载体pET32a进行连接,转化大肠杆菌BL21,使该基因得到了有效的表达,为进一步在食品级宿主菌中的表达奠定了基础。

β-1,3-1,4葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

以Bacillus subtilis为供体,pBR325载体,采用鸟枪法克隆了β-1,3-1,4葡聚糖酶基因bgl,并转化大肠杆菌后得到表达。结果表明,克隆子中插入的EcoRⅠ酶切片段长度为7.1kb,含有bgl基因。克隆子能合成专一地分解大麦β-葡聚糖的酶。宿主中的pBR325-bgl杂种质粒pFGl在无任何选择压力下较稳定。

发菜1,4-α-葡聚糖分支酶(GBE)的基因克隆及其对干旱胁迫的响应

由glgB基因编码的1,4-α-葡聚糖分支酶(GBE)是催化调控α(1-6)糖苷键分支合成的关键酶。本研究从发菜中克隆获得1,4-α-葡聚糖分支酶glgB基因全长2 292 bp(GeenBank登录号:KX679395),编码763个氨基酸。原核表达得到88.6 kD的glgB基因外源蛋白,MALDI-TOF-TOF/MS质谱分析表明外源蛋白为GBE。发菜glgB与点形念珠藻的glgB序列相似性为94%,氨基酸序列相似性为97%;GBE在第747位的甘氨酸疏水性最强,第168位的组氨酸亲水性最强;Thr有15个磷酸化位点,Tyr有12个磷酸化位点、Ser有27个磷酸化位点;GBE二级结构及三级结构由α螺旋、β折叠、随机卷曲和β转角构成。发菜glgB在干旱胁迫下转录水平的表达量逐渐增加,GBE含量增加,糖原合成酶活性和糖原含量均先增加后降低。研究结果为认识glgB基因信息和发菜响应干旱胁迫的糖原代谢和调控机制提供了依据。

由拟康氏木霉Trichoderma Pseudokoningii S—38菌株中分离得到的一个新的外切葡聚糖纤维二糖水解酶(CBH)

对拟康氏木霉 Trichoderma Pseudokoningii S—38菌株在玉米秸粉上生长后得到的粗酶液进行了全组分纯化分离。得到了一个物化和酶学性质与已有的外切葡聚糖纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)CBH(cellobiohydrolase)Ⅰ和Ⅱ性质不同的一个可酶解天然纤维素的组分——CBHX。它不水解 CMC(carboxymethy cellulose)、HEC(hydroxyethyl cellulose)、PNPG(P—nitrophyglucoside)和水杨素,但能水解 Avicel 和磷酸膨胀纤维素,在有内切葡聚糖酶存在时则能水解棉花。与 CBHI 在水解 Avicel 或棉花时无协同作用。相对分子质量为340000,等电点7.0。用微热量计测试表明,它可单独作用于棉纤维的结晶区,但检测不出水解产物。

幼年起病的2例晚发型糖原贮积症Ⅱ型/Pompe病临床和基因分析

目的对中国大陆地区幼年起病的晚发型糖原贮积症Ⅱ型(GSDⅡ,Pompe 病)患者进行临床和基因突变分析。方法对2例幼年起病的 Pompe 病患儿进行临床分析,提取患儿皮肤成纤维细胞及其父母的外周血 DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增α-1,4-葡萄糖苷酶的19个外显子,测序,进行突变检测。同时对50例健康对照100个等位基因进行15号外显子的 PCR 扩增,测序,确定突变特征。结果 1例临床表现为进行性近端肌肉无力,肌张力低下;1例表现为肌容积减少,呼吸肌受累;2例均有肌酸磷酸肌酶升高,肌电图提示肌源性损害,肌活检呈空泡性改变,皮肤成纤维细胞α-1,4-葡萄糖苷酶活性测定明显低下。突变检测:测序发现4个杂合错义突变,例1为 c796 C>T,p.266Pro>Ser;c2105 G>A,p.702Arg>His;例2为 c2132 C>G,p.711Thr>Arg;c2167 G>A,p.723Val>Met。其中后3个为新突变,50例健康对照100个等位基因测序未发现同样突变。结论幼年起病的 Pompe 病患儿临床表现存在差异,呼吸肌受累情况影响其预后;检测到3个错义新突变,可能为致病突变。

纤维素酶制剂中葡聚糖纤锥二糖水解酶活力的测定

根据真菌纤维素酶系中β-葡聚糖纤维二糖水解酶,内切β-葡聚糖酶以及纤维二糖酶在棉纤维上吸附和脱吸附性质的不同,拟订了一种可选择性地测定β-葡聚糖纤维二糖水解酶活力的方法。β-葡聚糖纤维二糖水解酶强烈吸附于棉纤维上,而且不为1 mol/L,pH4.8的醋酸缓冲液所洗脱;只有部分内切β-葡聚糖酶为棉纤维所吸附,但在上述条件下可完全被洗脱。纤维二糖酶不被吸附。在此基础上,再借助β-葡聚糖纤维二糖酶与内切β-葡聚糖酶的协同作用,可在后者过量存在的条件下,定量测定β-葡聚糖纤维二糖水解酶活力。用两种商品纤维素酶制剂验证了本方法的可靠性。

糖原累积病Ⅳ型的临床和病理特点

目的报道1例22岁男性糖原累积病Ⅳ型（Anderson disease）患者临床及病理特点。方法对该患者行详细的病史询问和体格检查、心脏和腹部超声检查、头颅影像学、肌电图以及肌肉病理检查。结果患者儿童期发病，主要表现为四肢近端肌肉运动不耐受和疲劳感，偶有心悸；腹部超声示肝硬化、门脉高压和巨脾，超声心动图示心肌肥大、二尖瓣和三尖瓣轻度关闭不全；四肢骨骼肌肌电图示肌源性损害。头颅影像正常。肌肉病理HE染色示肌纤维内大量嗜碱性物质沉积，沉积物糖原染色（PAS）染色呈强阳性，淀粉酶处理后部分阳性物质被消化。电镜下嗜碱性沉积物为分支状细丝样结构以及无定型的颗粒样物质。结论此例为国内首次报告的糖原累积病Ⅳ型，属于分支酶缺陷病，受累组织和器官以骨骼肌、肝脏、脾脏和心肌为主。

猪回肠末端转基因大米和亲本大米主要营养素的消化率

目的 比较转双反义淀粉分支酶（SBE）基因大米和亲本大米主要营养素的消化率.方法 7只五指山小型去势公猪进行回肠造瘘手术,术后小型猪按随机数字表法随机分为两组,采用交叉法分别喂饲转基因大米饲料和亲本大米饲料,收集食糜后分析两种大米中主要营养素的消化率.结果 转基因大米和亲本大米蛋白质的表观消化率分别为69.50%±4.50%、69.61%±8.40%（t=0.01,P=0.994）;真消化率分别为87.55%±4.95%、87.64%±9.40%（t=0.01,P=0.994）;脂肪消化率分别为72.86%±0.34%、77.89%±13.09%（t=0.95,P=0.378）,碳水化合物消化率分别为72.92%±7.43%、92.35%±5.88%（t=4.27,P=0.005）;转基因大米中17种氨基酸的表观消化率和真消化率与亲本大米没有差别.结论 转基因大米中碳水化合物消化率低于亲本大米,其余主要营养素的消化率与亲本大米具有实质等同性.

何首乌多糖的结构表征及其免疫调节活性研究

目的从何首乌Polygonum multiflorum中提取分离多糖,对其结构进行表征,并评价其免疫调节活性。方法采用水提、醇沉法从何首乌中提取粗多糖,经Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换色谱柱分离纯化得到何首乌多糖(PMT)。利用高效凝胶渗透色谱-十八角度激光光散射联用法(HPGPC-MALLS)测定PMT的绝对分子质量,采用PMP柱前衍生-高效液相色谱法(HPLC)测定单糖组成。采用二维核磁共振波谱(2D-NMR)对PMT的结构进行表征。采用四甲偶氮唑盐(MTT)法、中性红比色法和Griess法分别检测PMT对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的生长、吞噬活性和释放一氧化氮(NO)能力的影响。结果 PMT是一种α-1,4-葡聚糖,其绝对分子质量为3.96×105。PMT可显著促进RAW264.7细胞的增殖,促进细胞的吞噬能力,增加NO的释放量。结论何首乌来源的α-1,4-葡聚糖具有显著的免疫调节活性,具有药物开发潜力。