二型谷氨酸羧肽酶稳定表达细胞株的建立

为了深入研究二型谷氨酸羧肽酶 (glutamatecarboxypeptidaseⅡ ,GCPⅡ )功能和了解其在兴奋性氨基酸代谢过程中作用 ,拟构建GCPⅡ的表达载体 ,建立稳定表达细胞株 ;采用聚合酶链反应 ,酶切连接 ,和蓝白筛选的方法 ,构建表达载体 ;磷酸钙共沉淀的方法转染HEK2 93细胞 ,G4 18筛选阳性细胞克隆 ;逆转录聚合酶链反应和免疫荧光细胞染色的方法鉴定阳性细胞株。采用PCR方法扩增出GCPⅡ ;构建含有GCPⅡ基因的表达载体———pcDNA3 1 NA ;建立了细胞株HEK 2 93 NA。成功构建了GCPⅡ的表达载体 ,建立了稳定表达细胞株 ,为深入研究该酶的功能和兴奋性氨基酸毒性作用奠定了基础。

二型谷氨酸羧肽酶口服基因疫苗的制备及其降低大鼠麻醉药用量的初步研究

目的 研制携带二型谷氨酸羧肽酶 (GCPⅡ )的口服疫苗 ,探讨该疫苗对大鼠麻醉药用量的影响。方法 采用聚合酶链反应、酶切连接和蓝白筛选的方法 ,构建GCPⅡ的表达载体 ;用磷酸钙共沉淀的方法转染HEK2 93细胞 ,G4 18筛选阳性细胞克隆 ;逆转录聚合酶链反应和免疫荧光细胞染色的方法鉴定阳性细胞株 ;氯化钙法制备携带GCPⅡ表达载体的减毒鼠伤寒沙门氏菌口服疫苗(SL GCPⅡ ) ;采用原代培养的巨噬细胞吞噬SL GCPⅡ的方法 ,观察疫苗的体外表达情况 ;将 5 0只雄性SD大鼠随机分为A、B 2组 ,每组 2 5只 ,2组鼠的体重分别为 ( 174 g±13g)和 ( 172 g± 11g) ,差异无显著意义 (P =0 0 72 )。A组胃内灌注 6 0 0 μL、OD2 60 0 6SL GCPⅡ ,两周内 4次给药 ;B组为对照组 ,给予SL32 6 1,剂量和方法与A组相同。采用免疫荧光的方法检测大鼠循环中GCPⅡ抗体滴度 ,观察麻醉药戊巴比妥钠的用量。结果 扩增GCPⅡ基因并构建了含有GCPⅡ基因的表达载体———pCDNA3 1 GCPⅡ ;建立了细胞株HEK 2 93 GCPⅡ ;体外实验证明培养的巨噬细胞吞噬SL GCPⅡ后 ,能够有效表达GCPⅡ基因。体内实验发现口服疫苗能够激活 2 2 / 2 5只SD大鼠产生GCPⅡ抗体 ,实验组麻醉药戊巴比妥钠的用量 ( 36 9mg/kg± 1 6mg/kg)显著低于对照组 ( 4 0

鞘内注射2-PM PA 对大鼠慢性炎性痛的影响

目的：评价鞘内注射2-PMPA对大鼠慢性炎性痛的影响。方法雄性SD大鼠24只，4～6月龄，体重200～250 g ，采用随机数字表法，将其分为3组（ n＝8）：生理盐水组（NS组）、完全弗氏佐剂组（CFA组）和N-乙酰天冬氨酰谷氨酸肽酶抑制剂2-PMPA组。采用左侧足底注射CFA 100μl的方法制备大鼠慢性炎性痛模型；2-PMPA组给予CFA后即刻鞘内注射2-PMPA 100μg ，其它2组给予等容量生理盐水，1次/d ，连续3 d。分别于注射CFA前（基础状态，T1）和最后一次给予2-PMPA后（T2）测定热缩足潜伏期（TWL ）和机械缩足反应阈（PWT ），然后处死大鼠，取L4，5节段脊髓组织，采用Western blot法测定NR2B表达。结果与NS组比较，CFA组和2-PMPA组T2时TWL和 PWT均降低，脊髓NR2B表达上调（ P＜0.05）；与CFA组比较，2-PMPA组T2时TWL和PWT均升高，脊髓NR2B表达下调（ P＜0.05）。结论鞘内注射2-PMPA可减轻大鼠慢性炎性痛，其机制与抑制脊髓水平NR2B表达有关。