GCLC基因上游AHR/ARNT元件负性调控GCLC基因在大鼠支气管上皮细胞的表达

研究谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)基因上游调控序列中2个AHR/ARNT元件的功能,从而了解γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因转录调节特征.分别构建缺失2个位点AHR/ARNT元件的GCLC基因上游近端序列的萤光素酶报道基因载体以及含有2个AHR/ARNT元件核心序列的萤光素酶报道基因载体.转染大鼠支气管上皮细胞(RTE),比较检测野生与缺失报道载体的基因转录调控效率;利用电泳迁移率变动实验(EMSA)和超级迁移率变动实验检测AHR/ARNT元件与AHR以及ARNT因子的特异性结合;通过转染AHR因子真核表达质粒进一步确定AHR/ARNT元件与AHR结合在GCLC基因表达中的最终作用.结果显示,相比其野生序列,缺失AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085)和双缺失AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085,-215^-210)的GCLC上游调控序列报道载体在RTE显著提高萤光素酶表达(均P<0.05),而缺失AHR/ARNT元件(-215^-210)则未见显著影响(P>0.05);独立AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085)具有转录促进作用(P<0.05)而独立AHR/ARNT元件(-215^-210)无明显影响(P>0.05).转染CMV2-AHR能够抑制野生型和缺失型报道载体的萤光素酶表达(P<0.05).EMSA证实GCLC基因上游调控区域的2个AHR/ARNT元件均有核蛋白结合,并且超级迁移率变动实验显示结合的蛋白主要含有转录因子AHR以及ARNT.因此,2个AHR/ARNT元件均可以与异源二聚体AHR/ARNT结合,AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085)是GCLC基因中重要的抑制元件.

外周T细胞淋巴瘤组织中GCLC和GCLM的表达及其临床意义

目的:探讨外周T细胞淋巴瘤(PTCL)组织中谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节亚基(GCLM)的表达及其临床意义。方法:采用免疫组织化学法检测40例PTCL患者组织标本及20例淋巴结反应性增生组织中GCLC和GCLM的表达情况,分析其表达与PTCL患者临床病理特征的关系。结果:GCLC在PTCL组织中的阳性表达率为32.5%(13/40),在淋巴结反应性增生组织中未见明显表达,差异显著(P<0.05)。PTCL组织中GCLM的阳性表达率为35.0%(14/40),高于淋巴结反应性增生组织的10.0%,差异显著(P<0.05)。GCLC和GCLM的表达与PTCL患者的Ann-Arbor临床分期、B症状、国际预后指数(IPI)密切相关(P<0.05),但与患者的年龄、性别、乳酸脱氢酶(LDH)水平、骨髓侵犯均无关(P>0.05),且分期越晚(Ⅲ+Ⅳ期)、IPI(3~5分)越高者,GCLC和GCLM的阳性表达率越高。Spearman等级相关分析显示,PTCL组织中GCLC蛋白与GCLM蛋白的表达呈正相关。结论:GCLC和GCLM在PTCL组织中高表达,可能参与肿瘤的发生和发展,有望为PTCL的病因学研究及治疗提供理论依据。

转录因子DEC1和DEC2通过Ebox元件下调大鼠Gclc基因的表达

为研究Ebox元件在谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate-cysteine ligase catalyticsubunit,GCLC)基因表达中的地位,构建含Gclc上游5.9 kb调控序列,及突变Ebox(-3 853～-3 848)的萤火虫荧光素酶报道载体.转染大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(L2),比较野生与突变报道载体的转录活性.共转染野生型载体与转录因子分化型胚胎软骨发育基因1/2(differentiated embryochondrocyte expressed gene1/2,DEC1/2)真核表达载体,检测DEC1/2对Gclc转录活性的影响;电泳迁移率(electrophoretic mobility shift assays,EMSA)和超级迁移率实验(supershift assay)检测Ebox元件是否与DEC1/2特异结合.蛋白免疫印迹技术检测Dec1/2过表达对Gclc表达的影响.结果显示,载体构建符合预期;突变Ebox元件可显著上调Gclc荧光素酶活性(P<0.01);共转染DEC1/2表达载体显著下调Gclc荧光素酶活性(P<0.01);EMSA证实Ebox元件(-3 853～-3 848)与核蛋白结合,且特异性强;超级迁移率显示,结合的核蛋白有转录因子DEC1、DEC2;Western印迹结果显示,DEC1/2的表达明显下调Gclc的内源性表达.结果提示,转录因子DEC1与DEC2具有Gclc表达抑制活性,可能与Ebox(-3 853～-3 848)有关.

稳定表达大鼠GCLC启动子及荧光素酶报告基因细胞株的建立

目的:建立稳定表达大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)启动子及荧光素酶报告基因的大鼠肺泡上皮细胞株。方法:克隆大鼠GCLC上游5.9kb的启动子序列并构建重组报道载体PGL4.19-GCLC-LUC,转染到大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞L2,经G418筛选以获得单细胞抗性克隆并在传代过程中能稳定表达荧光素酶活性;检测细胞荧光素酶表达与细胞数量相关性;PCR检测稳定细胞株基因组已整合的插入片段;刺激因子刺激6h,检测稳定细胞株的反应性。结果:成功构建PGL4.19-GCLC-LUC;构建的稳定细胞株能稳定地表达荧光素酶,且与细胞数量正相关;PCR检测稳定细胞株目的片段稳定整合基因组;TNF-α刺激后,能使荧光素酶活性上升,差异有统计学意义(P<0.05);Rapamycin,GSH-EE刺激后,荧光素酶活性显著下降(P<0.05)。结论:成功构建稳定表达大鼠GCLC启动子及荧光素酶报告基因的细胞株,将为高通量药物筛选以及进一步研究GCLC基因的转录调控提供重要的细胞研究手段。

大鼠GCLC基因5’-上游调控区域(-876～+1)的3个E-box元件功能分析

目的:GCLC基因表达调控有助于在分子水平了解GSH变化的机制,对进一步探索机体抗氧化失衡的机制有重要意义。本实验主要研究GCLC基因上游调控区域(-876^+1)三个相邻E-box元件的作用及探讨E-box元件组合的基因转录作用机制。方法:利用PCR定点缺失法构建多种组合的缺失E-box元件的GCLC上游启动子序列的报告基因载体。将所构建的载体在脂质体介导下瞬时转染大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(L2细胞),通过比较转染后细胞的荧光素酶活性,分析E-box元件对GCLC基因转录活性的影响。结果:成功构建出多组定点缺失E-box元件的GCLC-Luc基因。在大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中转染缺失了E-box的GCLC-Luc组较转染GCLC-Luc组均有明显升高(P均<0.05)。结论:三个E-box元件(-804^-779,-729^-724,-590^-585)在GCLC基因的基础状态下的转录表达中都起到一定的抑制作用,可能以转录因子及元件复合物形式抑制GCLC基因的转录调控。此结果揭示GCLC基因上其他E-box元件之间也可能存在着相互作用方式,而非简单的单独作用。

慢病毒介导的稳定过表达人谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基基因的WRL68细胞株构建

目的利用慢病毒载体构建稳定过表达人谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)的WRL68细胞株。方法采用PCR方法合成GCLC基因全长,经Not I、Nsi I酶切后克隆到慢病毒载体LV6上;采用PCR、酶切、测序鉴定重组质粒LV6-GCLC;将重组质粒转染293T细胞,收集培养上清并感染WRL68细胞,经嘌呤霉素筛选出稳定过表达细胞株。采用增强型绿色荧光蛋白检测转染情况,采用Real-time PCR及Western blotting鉴定所构建的细胞株;MTT法检测细胞活性;采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞谷胱甘肽(GSH)含量。结果 PCR、酶切及测序结果表明重组慢病毒载体构建成功;重组慢病毒转染293T细胞后可观察到荧光及蛋白表达,包装过表达慢病毒并检测其浓缩滴度为1.0×109 TU/ml;用1μg/ml嘌呤霉素成功筛选出稳定过表达细胞株;GCLC过表达组中GCLC的m RNA和蛋白的表达量高于空载体转染组及对照组(P<0.05);GCLC过表达组、空载体转染组及对照组的细胞活性间比较,差异无统计学意义(P>0.05);GCLC过表达组GSH含量明显高于空载体转染组及对照组(P<0.05)。结论成功构建了稳定过表达人GCLC的WRL68细胞株。

双氢青蒿素对HepG2细胞氧化损伤和能量代谢的影响及其与索拉非尼的协同作用

目的:探讨双氢青蒿素(DHA)对HepG2细胞的增殖抑制作用,通过细胞氧化损伤及能量代谢交互通路的影响阐明其作用机制;并通过与索拉非尼(Sora)联用,探讨其联合用药的可能性。方法:选用HepG2细胞和SW480细胞,细胞增殖与活性检测(CCK-8)法分别得到DHA与Sora的半数抑制浓度(IC50);Chou-Talalay法分析DHA与Sora联用的联用指数(CI)。选用HepG2细胞,分为正常组,DHA单用组(10μmol·L^(-1)),Sora单用组(5μmol·L^(-1))和DHA与Sora联用组(DHA 10μmol·L^(-1),Sora 5μmol·L^(-1)),药物孵育8~12 h后,糖酵解速率试剂盒检测细胞糖酵解功能,线粒体压力试剂盒检测线粒体氧化磷酸化功能;DCFH-DA活性氧(ROS)探针检测细胞内ROS水平变化;脂质过氧化物丙二醛(MDA)检测试剂盒检测细胞内MDA水平变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞内血红素氧合酶1(HO-1)和谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)蛋白的水平变化。结果:与正常组比较,DHA单用组能够显著抑制HepG2细胞的线粒体氧化磷酸化ATP合成能力和糖酵解速率(P<0.01),升高细胞内ROS和MDA水平(P<0.05),降低HO-1,GCLC水平(P<0.05);DHA与Sora联用在HepG2和SW480细胞中均具有较好的协同抑制细胞增殖作用,其CI值<0.9;与DHA单用组比较,DHA与Sora联用组对HepG2细胞的线粒体氧化磷酸化ATP合成和糖酵解的抑制程度均显著增强(P<0.01);细胞内的ROS和MDA水平均显著升高(P<0.01);细胞内抗氧化相关蛋白HO-1,GCLC水平均显著降低(P<0.01)。结论:DHA可能通过降低HepG2细胞内的HO-1,GCLC水平,升高ROS使MDA水平增加,并造成细胞线粒体氧化损伤,抑制细胞糖酵解能力以及氧化磷酸化能力,从而抑制HepG2细胞增殖;DHA与Sora联用具有协同抑制HepG2细胞增殖的作用,其机制可能与协同造成细胞氧化损伤从而影响线粒体电子传递链,抑制细胞能量代谢有关。