抗Gly m Bd 28K单克隆抗体的制备及其免疫学特性

利用Gly m Bd 28K天然蛋白免疫BALB/c雌性小鼠,取小鼠脾脏细胞与杂交瘤细胞融合,筛选出2株能稳定分泌抗Gly m Bd 28K单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E3和2F4。体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体,经纯化后,得到2株均为Ig G1型的单克隆抗体m Ab1E3和m Ab2F4。间接ELISA方法测得m Ab1E3的效价达到1∶4.10×10~5,对Gly m Bd 28K蛋白的半数抑制率(IC_(50))为23.99μg·L^(-1),与花生蛋白、核桃蛋白等的交叉反应率均低于0.1%。该单克隆抗体的制备为Gly m Bd 28K致敏蛋白的检测以及抗原表位的鉴定奠定了基础。

大豆主要过敏原Gly m Bd 28K的同源建模和B细胞表位的预测

利用生物信息学软件SWISS-MODEL和Deep View 4.1对Gly m Bd 28K进行同源建模并对做出的模型进行评估。利用DNAStar和SOPMA分析Gly m Bd 28K的亲水性、柔韧性、表面可及性、抗原指数和二级结构,预测出Gly m Bd 28K的4个B细胞线性表位5-13,75-77,175-177,200-203。根据三级结构模型,通过Disco Tope 2.0预测出Gly m Bd 28K的6个与构象表位相关的区段11-14,40-41,43,114-115,185-192,194-207。

大豆主要过敏原Gly m Bd 28K基因的克隆表达、纯化及多抗血清的制备

RT-PCR克隆大豆主要过敏原Gly m Bd 28K基因,根据序列设计引物,扩增目的基因的开放阅读框,与MBP载体连接,测序鉴定,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,并用IPTG诱导表达.亲和层析法纯化重组蛋白,SDS-PAGE验证蛋白的纯度,免疫新西兰大白兔,收集多抗血清,用ELISA法测效价.扩增出含Gly m Bd 28K目的基因片段,诱导并获得高浓度和预期相符的表达产物,经层析纯化出Gly m Bd 28K蛋白,免疫新西兰大白兔,获得效价为1∶1.6×106多抗血清.

利用大豆核心种质部分样本鉴定28K和30K过敏蛋白缺失材料

以栽培大豆(G.max)核心种质经聚类随机选择样本为主,以栽培大豆保留种质和野生大豆(G.soja)为对照,利用小鼠单克隆抗体Gly m Bd 30K(F5)和Gly m Bd 28K(C5)分别检测大豆的30K和28K过敏蛋白抗原,目的是发掘过敏蛋白缺失的品种资源,明确其分布规律和特点,检测大豆核心种质的代表性,为资源和育种研究提供参考。鉴定结果表明,在参试的60份野生大豆和421份栽培大豆中没有发现30K过敏蛋白缺失的种质,但28K过敏蛋白缺失率分别为13.3%和37.8%。栽培大豆核心种质28K过敏蛋白缺失比率的变化趋势与栽培大豆保留种质总体规律基本相同,在3个生态区的缺失比率差异均不显著,说明核心种质在28K过敏蛋白缺失这个性状上具有代表性。SSR标记分析发现,在缺失过敏蛋白的种质中,80%相似系数在0.44以下,表明这些种质遗传基础较为广泛,可充分利用类群内或类群间差异较大的材料作为亲本配制杂交组合,培育缺失28K过敏蛋白优质品种。

栽培大豆蛋白亚基11S/7S组成及过敏蛋白缺失分析

以175份中国大豆品种资源为材料 ,利用SDS PAGE电泳和Western杂交技术 ,分析蛋白亚基 1 1S和 7S的含量 ,以及GlymBd 2 8K和GlymBd 30K两种过敏蛋白的缺失情况。结果表明 ,参试品种的 1 1S和 7S的含量呈极显著负相关(r=-0 95) ,1 1S 7S比值范围为 0 77～ 4 67,并鉴定出 1份自然缺失 β亚基的材料。在 1 75个品种中没有检测到缺失30K过敏蛋白的材料 ,但发现 77份缺失 2 8K过敏蛋白的品种 ,占被检测品种的 44 0 %。蛋白质高于 43 0 %的品种和蛋白质含量低于 43 0 %的品种中 2 8K过敏蛋白的缺失比例分别为 56 0 %和 2 8 0 % ;地方品种 ( 1 2 6份 )和选育品种 ( 49份 )中缺失 2 8K过敏蛋白比例分别为 48 4 %和 32 7% ;在北方春大豆、黄淮夏大豆和南方大豆中 ,2 8K过敏蛋白缺失的品种分别占 1 1 7%、60 7%和 60 9%。而这 3个栽培区的大豆品种中蛋白质含量高于 43 0 %的品种比例分别为 1 0 0 %、57 1 %和 88 5%。相关分析表明 ,2 8K过敏蛋白的缺失与蛋白质含量正相关 (r=0 1 4 )。

大豆过敏原与低过敏原种质创新

食物过敏是一个全世界关注的公共卫生问题。如何降低大豆过敏原含量,保证大豆食品安全,已成为日益关注的问题。大豆种子过敏原包括种子储藏蛋白、结构蛋白和防御相关蛋白,其中7S球蛋白组分中的Gly m Bd 28K,Gly m Bd 30K及β-伴球蛋白的Gly m Bd 60K是3种主要的过敏原。目前通过对过敏原的理化性质、过敏原性和基因结构的认识,运用传统育种及基因工程技术等方法,在减少大豆的过敏原性方面已取得一定的进展。文章对大豆过敏原的类型及特性、3种主要过敏原的理化性质、基因结构以及低过敏原种质创新等方面的研究报道进行了综述。