胀果甘草粗多糖及其纯化多糖对树突状细胞成熟和抗肿瘤作用的影响及机制

目的研究胀果甘草粗多糖(GiP)及其纯化多糖GiP-B1对荷瘤小鼠树突状细胞(DC)成熟和抗肿瘤作用的影响及机制。方法将体外培养的肝癌细胞H22荷瘤小鼠未成熟DC(imDC)分为对照组、肿瘤坏死因子α(TNF-α)组、GiP组及GiP-B1组,检测荷瘤小鼠成熟DC(mDC)的细胞活力,表面标志物(CD11c、CD80、CD86、MHC-Ⅱ)阳性表达率,白细胞介素12p70(IL-12p70)及IL-4水平;通过荷瘤小鼠m DC与CD4^(+)T淋巴细胞共培养生成CD4-细胞毒性T细胞(CD4-CTL),检测刺激指数,CD4-CTL上清液中IL-12p70、干扰素-γ(IFN-γ)、IL-4、IL-10水平及对H22细胞的杀伤活性;检测共培养后荷瘤小鼠mDC中IL-12、IL-12受体(IL-12R)、信号转导和转录激活因子4(STAT-4)mRNA表达量,以及IL-12Rβ2蛋白表达量,核转录因子κB(NF-κB)p65、STAT-4蛋白磷酸化水平。结果与对照组比较,GiP组与GiP-B1组荷瘤小鼠mDC细胞活力、MHC-Ⅱ阳性表达率以及IL-12p70、IL-4水平均显著升高(P<0.05),CD11c、CD80、CD86阳性表达率均有升高趋势,但差异均无统计学意义(P>0.05)。共培养后刺激指数、IL-12p70、IFN-γ水平均显著升高(P<0.05),IL-4、IL-10(GiP组除外)水平均显著降低(P<0.05),对H22细胞的杀伤活性均显著增强(P<0.05);荷瘤小鼠m DC中IL-12、IL-12R(GiP组除外)、STAT-4 mRNA表达量,IL-12Rβ2蛋白表达量以及NF-κB p65、STAT-4蛋白磷酸化水平均显著升高(P<0.05)。结论GiP及GiP-B1对荷瘤小鼠DC的成熟有较好的促进作用,能有效刺激CD4^(+)T细胞增殖并增强CD4-CTL的抗肿瘤活性,其作用机制可能与激活IL-12/NF-κB/STAT-4信号通路有关。

稀土元素对甘草细胞生长及甘草酸合成的影响

以胀果甘草根愈伤组织为材料,研究了在150mL摇瓶中,不同浓度的两种稀土离子镧、亚铈对甘草细胞生长及甘草酸分泌和释放的影响。结果表明,在悬浮培养初期、指数期加入稀土元素,改变了细胞生长状况,均使细胞在整体上生物量减少;不同种类的稀土离子、不同的稀土浓度对细胞生长影响强弱不同,但趋势相似。其中,培养指数期,加入500μL镧溶液的培养液中,所得甘草细胞生物量较多,利用薄层-紫外分光光度计法检测到甘草酸含量为67.68mg/g。

四种前体对胀果甘草细胞悬浮培养生产甘草黄酮的调控效果评价

在胀果甘草细胞悬浮体系中加入苯丙氨酸、酪氨酸、肉桂酸和乙酸钠来研究前体对甘草细胞生产甘草黄酮的影响。结果显示,4种前体在合适的浓度下对细胞的生长没有明显的抑制作用,而且均能促进细胞内甘草黄酮的生物合成,但高浓度的肉桂酸对细胞的生长有一定的抑制作用。苯丙氨酸的最佳添加浓度为20 mg/L,酪氨酸、肉桂酸、乙酸钠的最佳添加浓度都是5 mg/L。此时,均可使培养体系的甘草黄酮产量高达100 mg/L以上,其中酪氨酸的添加使得产量高达对照的1.43倍。苯丙氨酸、肉桂酸和乙酸钠3种前体的添加时间均以第10天为宜,酪氨酸添加时间以第5天为最佳。而且,在添加苯丙氨酸和乙酸钠后的第3天收获细胞,此时细胞的生物量和甘草黄酮产量最大。此外,苯丙氨酸、乙酸钠的添加可以增加黄酮合成的关键酶之一——苯丙氨酸裂解酶的活性。酪氨酸对苯丙氨酸裂解酶影响不大,而肉桂酸的添加却导致其活性显著降低。

甘草悬浮细胞培养生产甘草总黄酮的研究

探讨了胀果甘草和光果甘草愈伤组织诱导培养的条件,并建立了甘草的悬浮细胞系,同时还分析了甘草细胞中总黄酮的含量。结果表明,用浓硫酸处理40 min后,甘草种子的萌发率最高。在甘草愈伤组织诱导形成时,采用MS+2,4-D(1.0 mg·L-1)+6-BA(1.0 mg·L-1)+NAA(1.0 mg·L-1)培养基并以下胚轴为外植体的诱导率最高,达到90%,而且在继代培养基MS+NAA(0.5 mg·L-1)+2,4-D(0.5 mg·L-1)+6-BA(0.5 mg·L-1)中愈伤组织生长速度较快、状态最好。此外,在建立的甘草悬浮细胞系中,胀果甘草细胞株B12、B4和光果甘草细胞株G2的甘草总黄酮含量分别为干重的1.8%、1.2%和0.66%。

茉莉酸甲酯与二氢茉莉酮酸甲酯对悬浮培养的甘草细胞生长和黄酮积累的影响

建立了稳定的甘草细胞悬浮培养体系,在一个培养周期内,细胞的生长曲线呈"S"型,培养21d的干重、鲜重和黄酮产量都达到最高值。甘草细胞悬浮培养体系中分别添加100μmol·L-1二氢茉莉酮酸甲酯和茉莉酸甲酯时,虽然对细胞生长有一定程度的抑制,但细胞中甘草黄酮产量仍有提高。添加二氢茉莉酮酸甲酯和茉莉酸甲酯的最适时间分别为细胞培养后的第5天和第10天。

外源水杨酸对悬浮培养甘草细胞中甘草黄酮积累的影响

甘草细胞悬浮培养体系中添加10 mg·L^(-1)水杨酸可促进和提高甘草细胞的生长和甘草总黄酮产量。添加水杨酸可导致细胞中过氧化氢含量升高,引起细胞中苯丙氨酸裂解酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活性的增强以及丙二醛含量的升高。

甘草悬浮细胞的玻璃化法超低温保存研究

以甘草悬浮细胞为材料,进行了超低温保存技术的研究。高产黄酮的甘草悬浮细胞是一种极具价值但又难于保存的材料,为解决甘草细胞超低温保存中存在的关键问题,即如何减少渗透压的突然改变对细胞造成损伤,通过优化预培养时间、细胞年龄、预处理时间、脱水时间、洗涤液蔗糖浓度等影响因素,建立了一套适合于甘草悬浮细胞的保存方法。采用改良的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)法检测,此法存活率可达82.9%。将保存后的细胞进行恢复培养,其恢复生长率可达80.4%。

胀果甘草多糖佐助的树突状细胞疫苗对H22肝癌荷瘤小鼠的免疫治疗作用

目的:制备胀果甘草多糖佐助的树突状细胞(dendritic cell,DC)疫苗,研究其对H22肝癌荷瘤小鼠的免疫治疗作用。方法:从小鼠骨髓中分离培养得到骨髓源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDC),用H22肝癌抗原致敏DC,再加入一定浓度的胀果甘草多糖佐剂制备DC疫苗,用倒置显微镜观察DC形态变化、流式细胞仪检测DC疫苗表型。建立H22肝癌荷瘤小鼠模型,按数字表法随机分为模型组、阳性组、DC组、TNF-α组、GiP组和GiP-B1组,用胀果甘草多糖佐助的DC疫苗免疫治疗荷瘤小鼠2次。末次给药后第5天处死小鼠,检测脏器指数及抑瘤率;酶联免疫法检测小鼠血清中IL-12(P70)、IFN-γ、IL-4和IL-10细胞因子含量;HE染色观察小鼠肝脏和肿瘤组织病理形态变化;免疫组化检测肿瘤组织Bax和Bcl-2蛋白的表达水平。结果:胀果甘草多糖作为DC疫苗佐剂,能够上调DC表面标志分子的表达水平(P<0.05);胀果甘草多糖佐助的DC疫苗能够减缓肝癌小鼠肿瘤生长速度,升高肝癌小鼠脾脏指数和胸腺指数(P<0.05),增加肝癌小鼠血清中IL-12和IFN-γ含量(P<0.05),降低IL-10和IL-4含量(P<0.05),提高肿瘤组织Bax/Bcl-2比值(P<0.01)。结论:胀果甘草多糖作为DC疫苗的佐剂,可以体外诱导DC成熟及活化,胀果甘草多糖佐助的DC疫苗对肝癌小鼠具有一定的免疫治疗作用,其抗肿瘤作用机制可能与促进DC成熟增加IL-12和IFN-γ的分泌,介导细胞免疫,并促进肿瘤细胞凋亡有关。